胡明沛 王丹丹 徐明波 楊仲璠 曹榮月

1.中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇南京 210009；2.北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司北京市重組蛋白及其長效制劑工程技術(shù)研究中心，北京 100143

促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）是一種糖蛋白激素，受缺氧誘導(dǎo)，其主要作用是抑制骨髓中紅系祖細胞的凋亡并促進其增殖、分化和成熟，臨床上多用于治療腎性貧血及腫瘤、早產(chǎn)等相關(guān)性貧血。近些年來，已在多種組織系統(tǒng)中觀察到EPO 具有抑制細胞凋亡、減輕炎癥反應(yīng)、抵抗氧化應(yīng)激及促進血管生成等保護作用，特別是神經(jīng)系統(tǒng)[1]。然而EPO 用作神經(jīng)保護劑時給藥劑量較高，容易激發(fā)其造血活性，增加了高血壓及血栓形成等風(fēng)險[2]。規(guī)避該副作用的主要方法是使用非促紅EPO 衍生物[3]，不同形式的EPO 衍生物作用機制有所不同，但均顯示出抗氧化、抗凋亡與抗炎特性，已有越來越多的研究在動物及臨床試驗中證實了EPO 及其衍生物在治療神經(jīng)退行性疾病中的重要作用。

1 EPO 與EPOR

人EPO 基因定位于7 號染色體長臂中段，由5個外顯子和4 個內(nèi)含子組成。體內(nèi)存在的活性EPO 分子含有165 個氨基酸，相對分子量為30.4 kD。EPO 通過兩對二硫鍵形成4 個穩(wěn)定的α 螺旋結(jié)構(gòu)（A-D），其中A、C、D 是疏水性螺旋，參與結(jié)合促紅細胞生成素受體（erythropoietin receptor，EPOR）。已在多種非紅系組織中檢測到EPO 和EPOR，提示EPO 具有非造血作用[4]。

EPOR 相對分子量為66 kDa，屬于Ⅰ型細胞因子受體超家族，主要包括三個部分：一個胞外結(jié)構(gòu)域，其包含兩對提供配體結(jié)合位點的半胱氨酸殘基和一段保守基序（WSXWS）；一個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個缺乏催化活性的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在造血系統(tǒng)中，EPO 與其經(jīng)典受體的同型二聚體（EPOR）2結(jié)合并激活胞漿中的Janus 激酶2（Janus kinase 2，JAK2），活化的JAK2 使EPOR 胞漿結(jié)構(gòu)域中的8 個酪氨酸殘基磷酸化，隨后激活幾種次級信號分子：信號轉(zhuǎn)錄激活因子5（signal transducer and activator of transcription 5，STAT5）、磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK），從而促進紅系祖細胞增殖、分化為成熟的紅細胞，發(fā)揮其主要的造血功能[5]。

2 EPO 衍生物與β 共同受體（Common β chain receptor，βCR）

第一個非促紅EPO 衍生物是去唾液酸EPO（asialo-EPO），其糖鏈末端缺乏唾液酸殘基保護，極易被肝臟中脫唾液酸蛋白受體識別從而被快速代謝，血漿半衰期由普通EPO 的約6 h 降至幾分鐘。值得一提的是，雖然組織保護性受體對EPO 的親和力明顯低于促紅受體，但短暫接觸足以誘導(dǎo)神經(jīng)保護作用的產(chǎn)生。而EPO 發(fā)揮促紅作用需要長時間結(jié)合（EPOR）2，造成這種差異的原因尚未完全確定[6]。因此，asialo-EPO 理論上可以發(fā)揮組織保護作用而不產(chǎn)生促紅作用，但原則上它仍然能夠激活（EPOR）2，多次大劑量的使用仍可能影響紅細胞生成，且不利于深入研究EPO 保護作用機制，所以人們希望能夠制備一種不與（EPOR）2結(jié)合但仍具有組織保護作用的EPO 衍生物[7]。

氨甲酰EPO（carbamylated erythropoietin，CEPO）即被開發(fā)出來，其是EPO 賴氨酸殘基氨甲酰化的產(chǎn)物，也是第一個真正意義上被嚴(yán)格證實不具有促紅活性的EPO 衍生物，因其既不與同二聚體（EPOR）2結(jié)合也不與單體EPOR 結(jié)合。但它仍然在包括大腦、心臟和腎臟等器官中呈現(xiàn)出與EPO 和asialo-EPO 相似的組織保護作用，Brines 等[8]認為這種組織保護作用是由EPOR與βCR 組成的異質(zhì)二聚體EPOR/βCR 介導(dǎo)的。

βCR，又名CD131，與EPOR 同屬于Ⅰ型細胞因子受體超家族，是粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GMCSF）、白細胞介素（interleukin，IL）-3 及IL-5 等的共享受體[9]。已在包括神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、腎臟在內(nèi)的多種組織器官中檢測到EPOR 和βCR 的共表達，并證明了EPO 通過結(jié)合EPOR/βCR 介導(dǎo)組織保護作用[10]。

低唾液酸EPO（neuro-EPO）是唾液酸含量在4～7 mol/mol 的重組EPO 亞型，目前已進入腦部疾病的臨床研究，主要通過鼻內(nèi)途徑進行給藥[11]。在神經(jīng)疾病治療中，對于以唾液酸含量為出發(fā)點設(shè)計的EPO衍生物與EPO 本身，鼻腔給藥是更理想的給藥方式，因其可以繞過血腦屏障將藥物直接遞送至大腦，同時避免被肝臟代謝，所以只需給予較低劑量的EPO 即可發(fā)揮神經(jīng)保護作用，大大降低了促紅作用帶來的血栓形成等風(fēng)險，且起效更快[12]。

對EPO 構(gòu)效關(guān)系的研究表明，螺旋B 遠離EPO與EPOR 的結(jié)合位點，Brines 等[13]模擬了螺旋B 外部的親水性表面，設(shè)計了一段包含11 個氨基酸殘基的線性小分子多肽，即螺旋B 表面肽（helix B surface pep tide，HBSP），又名ARA290，其N 末端谷氨酰胺自發(fā)環(huán)化形成焦谷氨酸HBSP（pyroglutamate HBSP，pHBSP），由此具有更高的穩(wěn)定性。與CEPO 相似，pHBSP 同樣不與EPOR 結(jié)合，已證明其通過結(jié)合EPOR/βCR 在腎臟、大腦、心臟、肺等器官中發(fā)揮組織保護作用[14]?；贓PO 結(jié)構(gòu)及其多樣性受體的進一步研究，其他EPO模擬肽也在陸續(xù)開發(fā)中，包括Epobis、Epotris、JM-4、MK-X、NP1 和NP2 等[15]。

3 EPO 的神經(jīng)保護作用及其機制

目前對EPO 在神經(jīng)系統(tǒng)中作用與機制的研究，大量集中在缺血性腦損傷、阿爾茨海默癥（Alzheimer′s disease，AD）和帕金森癥（Parkinson′s disease，PD）等神經(jīng)退行性疾病領(lǐng)域。

3.1 缺血性腦損傷

缺血性腦損傷的病理特征是細胞能量儲備耗竭，引起Na+/K+泵衰竭、電壓控制鈣通道開放及谷氨酸釋放并激活脂酶、一氧化氮（nitric oxide，NO）合成酶等，導(dǎo)致NO 過量產(chǎn)生、氧自由基生成及炎癥細胞因子釋放，最終激活半胱氨酸蛋白酶（cysteine aspartate-specific protease，Caspase）及其他凋亡分子，導(dǎo)致細胞死亡[16]。臨床前研究表明EPO 在體內(nèi)外均能抵抗由缺血和缺氧引起的神經(jīng)元死亡，這取決于多種不同的機制，包括：抑制缺氧缺血導(dǎo)致的腦組織中NO 含量激增；上調(diào)抗氧化酶活性，保護大腦免受氧自由基的侵害，并改善高氧誘導(dǎo)的髓鞘缺陷[17]；抑制谷氨酸的細胞外釋放；減輕炎癥反應(yīng)，下調(diào)IL-1、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 及IL-6 等炎癥細胞因子的表達；保護神經(jīng)膠質(zhì)細胞及海馬神經(jīng)元，抵抗腦細胞凋亡[18]。

對EPO 在新生兒大腦中產(chǎn)生抗凋亡作用的相關(guān)分子機制的研究如下：缺氧上調(diào)少突膠質(zhì)細胞及海馬神經(jīng)元上EPOR 的表達，EPO 與EPOR 結(jié)合后磷酸化JAK2，隨后激活下游相關(guān)信號通路，如：PI3K、STAT5、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）及MAPK家族中的胞外信號調(diào)節(jié)激酶 （extracellular signal-reg ulated kinases，ERK），這些信號通路的激活能夠增強抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-XL 的表達，進而維持線粒體外膜通透性，阻止細胞色素C（Cytochrome C）的釋放，最終抑制Caspase-9、Caspase-3 的活化，從而保護細胞免于凋亡[19]。此外，EPO 還具有促神經(jīng)發(fā)生與血管生成的作用，這種作用的產(chǎn)生部分來源于EPO 對血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達上調(diào)及對VEGF/VEGFR-2 信號通路的激活[20-21]。

3.2 AD

AD 的病理特征是β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ） 在神經(jīng)元細胞外異常沉積形成的老年斑及tau 蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)，臨床表現(xiàn)多為認知功能下降及記憶力減退等[22]。AD 是第二大最為常見的神經(jīng)退行性疾病，其病理特征是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元死亡及黑質(zhì)殘存神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性包涵體，即路易小體，其主要成分是α 突觸核蛋白[23]，臨床表現(xiàn)多為運動遲緩、肌強直及靜止性震顫等[24]。盡管兩者發(fā)病機制不同，但具有相似的演變過程：興奮性毒性、氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥、線粒體功能障礙、神經(jīng)元死亡和反應(yīng)性膠質(zhì)化[21-24]，已證明EPO能夠抵抗這些變化從而改善臨床癥狀[25]。

以AD 為例，簡要闡述EPO 發(fā)揮以上作用的具體表現(xiàn)及部分分子機制[26]（圖1）。將PC12、SH-SY5Y 細胞系及海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)物暴露于Aβ 肽或其片段（如Aβ25-35）可引起氧化應(yīng)激與過度磷酸化的tau蛋白（hyperphosphorylated tau，tau-p）積聚，最終導(dǎo)致細胞凋亡。EPO 能夠有效抵抗PC12 細胞及海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)物中Aβ25-35 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激與谷氨酸誘導(dǎo)的興奮性毒性造成的線粒體損傷，并上調(diào)Bcl-2/Bax 比值，從而抑制Caspase-3 活性與細胞凋亡。在另一項Aβ25-35 誘導(dǎo)的AD 細胞模型中發(fā)現(xiàn)，EPO 可以通過PI3K/AKT 途徑抑制由tau-p 積聚引起的糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）的過度激活，而GSK-3β 可以促進凋亡蛋白的釋放[26]。在AD 患者和動物模型中，神經(jīng)膠質(zhì)細胞的過度活化是神經(jīng)炎癥和細胞損傷的標(biāo)志?；罨哪z質(zhì)細胞釋放大量炎癥細胞因子（如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8）與氧自由基，直接促進細胞凋亡并引發(fā)認知功能障礙，而AD 大鼠經(jīng)體內(nèi)注射EPO 后，炎癥反應(yīng)減輕，認知功能改善[27]。

圖1 EPO 對AD 中Aβ 和tau-p 異常積聚引起的神經(jīng)損傷的保護作用

3.3 PD

同樣已在多種體外及體內(nèi)PD 模型中觀察到EPO的神經(jīng)保護作用，EPO 可以抑制6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的PC12 細胞凋亡及魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細胞凋亡[1]。此外，EPO 對星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元及小膠質(zhì)細胞的神經(jīng)保護作用機理并不相同。具體來講，EPO 通過抑制依賴于MAPK 信號通路的水孔蛋白AQP4 的表達減輕星形膠質(zhì)細胞腫脹并改善血腦屏障通透性，通過降低磷脂酰絲氨酸受體表達抑制小膠質(zhì)細胞反應(yīng)性膠質(zhì)化并間接抑制神經(jīng)元凋亡[28]。促紅細胞生成素釋放神經(jīng)前體細胞（erythropoietin-releasing neural precursors cells，Er-NPCs） 是心室下區(qū)來源的神經(jīng)前體細胞的一個亞類，它們呈現(xiàn)更高的神經(jīng)分化。單側(cè)紋狀體定向注射Er-NPCs 可以快速起到抗炎作用，其通過調(diào)節(jié)炎性細胞因子及抗炎細胞因子的表達，直接抵消小膠質(zhì)細胞的M1 樣促炎反應(yīng)并誘導(dǎo)M2 樣促再生作用，分化和挽救退化的多巴胺能神經(jīng)元，且抗EPO 抗體與Er-NPCs 的共同注射可以中和Er-NPCs的抗炎作用，這表明Er-NPCs 的抗炎活性是由其釋放的EPO 介導(dǎo)的[29-30]。最新研究發(fā)現(xiàn)，EPO 還可以通過加快糖酵解速率提升細胞內(nèi)ATP 水平，以挽救線粒體損傷并改善氧化還原失衡和神經(jīng)炎癥，最終抑制多巴胺能神經(jīng)元變性，恢復(fù)其細胞活力[31]。

4 EPO 衍生物的神經(jīng)保護作用及其機制

考慮到本綜述的部分目的在于比較結(jié)構(gòu)與作用方式差異較大的EPO 及其衍生物的神經(jīng)保護作用與機制，因此本部分主要以pHBSP 作為敘述對象。對于asialo-EPO 與neuro-EPO，盡管兩者通過降低唾液酸化水平顯著縮短了血漿半衰期，但理論上二者仍可以結(jié)合（EPOR）2，多次大劑量的給藥依然具有高血壓與血栓形成等風(fēng)險[26]，因此不是理想的神經(jīng)保護劑。不過值得一提的是，neuro-EPO 通過鼻腔給藥的方式似乎完全規(guī)避了這種風(fēng)險，并已在臨床試驗中顯示出有益效果，遺憾的是，目前尚不明確鼻腔給藥下neuro-EPO 的藥物動力學(xué)[11]。CEPO 已被多項研究證明即使在長期給藥下也不會產(chǎn)生促紅作用，并在多種神經(jīng)疾病中顯示出保護作用[32]。但CEPO 存在生產(chǎn)成本高、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定及潛在的抗體形成等問題，限制了其在臨床治療中的應(yīng)用[33]。而pHBSP 作為一段僅與EPOR/βCR 特異性結(jié)合的只有11 個氨基酸組成的小分子多肽顯然更具優(yōu)勢，包括更容易穿越血腦屏障等，且雖然靜脈注射后其血漿半衰期只有幾分鐘，但仍可以發(fā)揮持續(xù)的生物學(xué)效應(yīng)，這可能部分依賴于參與其作用機制的相關(guān)信號通路[14]（圖2），比如持久存活途徑PI3K/AKT 的激活可能介導(dǎo)了pHBSP 較長時間的組織保護作用[14]。

圖2 pHBSP 的生物活性涉及細胞內(nèi)多條信號通路

已在體外、體內(nèi)及臨床試驗中觀察到pHBSP 的神經(jīng)保護作用且均未觀察到高血壓與血栓形成等副作用。體外研究表明EPO 可以抑制運動神經(jīng)元中卡因酸誘導(dǎo)的谷氨酸興奮性毒性[13]。在癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠模型中，pHBSP 可以促進海馬神經(jīng)元的分化和存活并改善癲癇大鼠的認知缺陷[34]。在一項針對22 名結(jié)節(jié)病患者的雙盲、隨機、對照試驗中，靜脈注射pHBSP第4 周，疼痛強度和小纖維神經(jīng)病變篩查列表（small fibroneuropathy screening list，SFNSL） 評分顯著降低，表明pHBSP 可以減輕結(jié)節(jié)病患者中的小纖維神經(jīng)病變[35]。對患有神經(jīng)病變癥狀的2 型糖尿病患者皮下注射pHBSP，受試者表現(xiàn)出血紅蛋白A1c 和脂質(zhì)分布的改善，通過PainDetect 調(diào)查表評估的神經(jīng)病理性疼痛也得到了顯著降低，表明pHBSP 有助于改善2 型糖尿病患者的代謝控制和神經(jīng)病變[36]。

5 小結(jié)

綜上所述，EPO 是一種復(fù)雜的多效性細胞因子，其作用取決于細胞類型、給藥濃度與生理狀況等具體的反應(yīng)環(huán)境。在神經(jīng)系統(tǒng)中，EPO 以上述環(huán)境依賴性的方式結(jié)合多種受體并激活相應(yīng)的信號級聯(lián)以實現(xiàn)神經(jīng)保護與神經(jīng)修復(fù)功能。盡管在具體細胞與具體損傷類型中的作用不盡相同，但可以概括地表述為抗氧化、抗炎與抗凋亡，這些共性的作用提示了EPO 在神經(jīng)退行性疾病中的治療潛力。為避免促紅作用帶來的血栓形成等風(fēng)險，特異性地針對組織保護性受體的EPO衍生物被開發(fā)出來，已在神經(jīng)退行性疾病的動物模型與臨床研究中觀察到EPO 及其衍生物產(chǎn)生的有益效果。此外，鼻腔給藥也是一種可行的途徑，其臨床限制性主要體現(xiàn)在相關(guān)藥動學(xué)與藥效學(xué)尚未明確?？傊?，EPO 具有明顯的神經(jīng)保護作用，對其構(gòu)效關(guān)系與多樣性受體的進一步研究促進了非促紅EPO 衍生物的開發(fā)，進一步闡明了EPO 的神經(jīng)保護作用機制，同時為多種神經(jīng)疾病的臨床治療提供了有效的解決方案。