肖雪飛 趙四林 王偉 符艷

非小細(xì)胞肺癌具有高轉(zhuǎn)移潛力，導(dǎo)致臨床預(yù)后不良，近年來，非小細(xì)胞肺癌的治療取得了重要進展，但在轉(zhuǎn)移性疾病其總體治愈率和生存率仍然很低[1-2]。研究表明circRNA與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移具有密切關(guān)系，有望成為一種理想的生物標(biāo)志物，用于非小細(xì)胞肺癌的早期診斷，并提供新的治療靶點和預(yù)后監(jiān)測點[3]。研究報道circ_0081664在肺癌順鉑耐藥細(xì)胞株中，顯著上調(diào)[4]。然而circ_0081664對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移的影響及機制尚不清楚。研究報道m(xù)iR-1205在非小細(xì)胞肺癌中起腫瘤抑制作用，可以抑制裸鼠中A549移植瘤的生長[5]。miR-1205在人喉鱗狀細(xì)胞癌組織中被下調(diào)，miR-1205過表達減弱了人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移，生長和侵襲[6]。因此，本實驗旨在研究circ_0081664對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移的影響及其機制，是否與miR-1205有關(guān)。

資料與方法

一、組織材料

選取2016年1月至2020年5月期間本院收治的30例非小細(xì)胞肺癌患者，通過手術(shù)取其癌組織及相應(yīng)的癌旁組織，取出標(biāo)本后立即置于液氮中，而后置于-80℃冰箱中保存；入選患者未經(jīng)過放化療，所有患者均知情且同意。

二、主要試劑

A549細(xì)胞(貨號：HZ-H122，上海滬震實業(yè)有限公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(貨號：GNM-31800，上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司)；熒光定量PCR試劑盒(貨號：218073，上海研卉生物科技有限公司)；MTT試劑盒(貨號：GOY-9134，上海谷研實業(yè)有限公司)；凋亡檢測試劑盒(貨號：FXP018，北京四正柏生物科技有限公司)；Transwell小室、Matrigel(貨號：354483、354277，美國Corning公司)；RIPA蛋白裂解液(貨號：00000190，上海北諾生物科技有限公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(貨號：12535，上海宇勁生物技術(shù)有限公司)。si-NC、si-circ_0081664、pcDNA-NC、pcDNA-circ_0081664、miR-NC、miR-1205(百奧邁科生物技術(shù)有限公司)。Ki-67、Bcl2、MMP-2、MMP-9、P21、Bax抗體(深圳市豪地華拓生物科技有限公司)。

三、細(xì)胞分組

A549細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，將si-NC、si-circ_0081664、pcDNA-NC、pcDNA-circ_0081664、miR-NC、miR-1205分別轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，記為si-NC組、si-circ_0081664組、pcDNA-NC組、pcDNA-circ_0081664組、miR-NC組、miR-1205組；將si-circ_0081664分別與anti-miR-NC、anti-miR-1205共轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，記為si-circ_0081664+anti-miR-NC組、si-circ_0081664+anti-miR-1205組。

四、實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測circ_0081664和miR-1205的表達水平

取適量組織及各組細(xì)胞，提取其總RNA，合成cDNA后進行熒光定量PCR，反應(yīng)條件為95℃ 3 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環(huán)；circ_0081664和miR-1205分別以GAPDH和U6為內(nèi)參，用2-△△Ct法計算其相對表達量。circ_0081664上游引物序列：5′-AGTCTGGACCTGTCAGGATTG-3′，下游引物序列：5′-ACTGGCACAAGGCAGTAACA-3′；GAPDH上游引物序列：5′-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3′，下游引物序列：5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′；miR-1205上游引物序列：5′-CCCTCTGCAGGGTTTGCTTTGAG-3′，下游引物序列：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6上游引物序列：5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，下游引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3′；引物由上海生工生物工程公司合成。

五、 MTT實驗

在各組細(xì)胞培養(yǎng)至24 h時，每孔分別加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩反應(yīng)10 min使沉淀溶解，用酶標(biāo)儀于波長490 nm處檢測吸光度(OD490 nm)值。

六、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

取轉(zhuǎn)染24 h后生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，吸棄上清液，PBS漂洗細(xì)胞2次，加入結(jié)合緩沖液重懸，分別加Annexin V-FITC和PI各5 μL，輕搖混勻，再加入結(jié)合緩沖液350 μL，混勻，常溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測。

七、Transwell小室實驗

遷移實驗：將細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基以5×105細(xì)胞/mL的密度懸浮，將100 μL懸浮液添加到Transwell小室上室，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，用棉簽除去膜頂表面上未遷移的細(xì)胞；然后用甲醇固定30 min，PBS洗滌細(xì)胞后再用1%的結(jié)晶紫染色30 min，用PBS輕輕清洗兩次，風(fēng)干后用倒置顯微鏡拍攝并計數(shù)細(xì)胞。侵襲實驗用Matrigel覆蓋Transwell小室上室，其余步驟與遷移實驗相同。

八、Western blot實驗

提取細(xì)胞總蛋白，通過電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，封閉液封閉后加入Ki-67、Bcl2、MMP-2、MMP-9、P21、Bax一抗(1 ∶800)，4℃孵育過夜，加入二抗(1 ∶1200)室溫孵育2 h，用ECL發(fā)光液顯影，成像后檢測蛋白條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，蛋白相對表達水平為目的條帶和β-actin條帶灰度值的比值。

九、雙熒光素酶報告實驗

使用在線軟件Starbase預(yù)測circ_0081664和miR-1205的靶向結(jié)合位點。使用PCR擴增，包含miR-1205結(jié)合位點的circ_0081664序列片段(上游引物：5′-AAAGTCGACACTTCCTGCAGT-3′，下游引物5′-CCCGTCGACACTGGCACAAGGCAGTAACA-3′)，并構(gòu)建至pmir-GLO luciferase載體中，獲得circ_0081664野生型載體(WT-circ_0081664)，將circ_0081664序列 UGCAAAAG突變?yōu)镚UACCG，獲得circ_0081664突變型載體(MUT-circ_0081664)，將WT-circ_0081664、MUT-circ_0081664分別與miR-NC、miR-1205共轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，檢測熒光素酶活性。

十、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、 circ_0081664和miR-1205在組織中的表達

與癌旁組織比較，肺癌組織中circ_0081664表達水平升高，miR-1205表達水平降低(P<0.05)(見表1)。

表1 circ_0081664和miR-1205在組織中的表達

二、抑制circ_0081664表達對A549細(xì)胞增殖、凋亡及遷移侵襲的影響

與si-NC組比較，si-circ_0081664組A549細(xì)胞活性降低，Ki-67、Bcl2、MMP-2、MMP-9表達水平降低，P21、Bax表達水平升高，細(xì)胞凋亡率升高，遷移侵襲細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)(見表2，圖1、2)。

圖1 抑制circ_0081664表達對A549細(xì)胞增殖、凋亡及遷移侵襲相關(guān)蛋白表達的影響A：增殖相關(guān)蛋白表達；B:凋亡相關(guān)蛋白表達；C：遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達

圖2 抑制circ_0081664表達對A549細(xì)胞凋亡及遷移侵襲的影響A：凋亡圖；B:遷移、侵襲圖(結(jié)晶紫染色, ×200)

表2 抑制circ_0081664表達對A549細(xì)胞增殖、凋亡及遷移侵襲的影響

三、 circ_0081664靶向調(diào)控miR-1205的表達

Starbase預(yù)測顯示circ_0081664的序列中含有與miR-1205互補的核苷酸序列(圖3)。WT-circ_0081664與miR-1205共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光素酶活性降低(P<0.05)，MUT-circ_0081664與miR-1205共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光素酶活性無顯著變化(見表3)。與pcDNA-NC組比較，pcDNA-circ_0081664組miR-1205表達水平降低；與si-NC組比較，si-circ_0081664組miR-1205表達水平升高(P<0.05)(見表4)。

表3 雙熒光素酶報告實驗

圖3 circ_0081664的序列中含有與miR-1205互補的核苷酸序列

表4 circ_0081664靶向調(diào)控miR-1205的表達

四、過表達miR-1205對A549細(xì)胞增殖、凋亡及遷移侵襲的影響

與miR-NC組比較，miR-1205組A549細(xì)胞活性降低，Ki-67、Bcl2、MMP-2、MMP-9表達水平降低，P21、Bax表達水平升高，細(xì)胞凋亡率升高，遷移侵襲細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)(見表5，圖4-5)。

表5 過表達miR-1205對A549細(xì)胞增殖、凋亡及遷移侵襲的影響

五、干擾miR-1205表達逆轉(zhuǎn)抑制circ_0081664表達對A549細(xì)胞增殖、凋亡及遷移侵襲的影響

與si-circ_0081664+anti-miR-NC組比較，si-circ_0081664+anti-miR-1205組A549細(xì)胞活性升高，Ki-67、Bcl2、MMP-2、MMP-9表達水平升高，P21、Bax表達水平降低，細(xì)胞凋亡率降低，遷移侵襲細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05)(見表6，圖6、7)。

表6 干擾miR-1205表達逆轉(zhuǎn)抑制circ_0081664表達對A549細(xì)胞增殖、凋亡及遷移侵襲的影響

討 論

非小細(xì)胞肺癌是肺癌的主要發(fā)病類型，隨著分子靶向藥物治療進展，使得非小細(xì)胞肺癌的治療方案更加個體化，精確化[7-8]。circRNA在肺癌的發(fā)生，轉(zhuǎn)移和預(yù)后中起關(guān)鍵作用，可以作為潛在的腫瘤診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物[9]。研究報道circPTK2過表達抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移[10]。抑制circRNA 100146可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲并促進細(xì)胞凋亡[11]。敲除circZFR可以顯著抑制體外培養(yǎng)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲[12]。circ_0081664來源于LRWD1的一種環(huán)狀RNA，位于chr7:102107785-102109101；已有研究表明circ_0081664在肺癌順鉑耐藥細(xì)胞株中顯著上調(diào)[4]。本實驗結(jié)果顯示，肺癌組織中circ_0081664表達水平升高，提示circ_0081664可能在肺癌中起促癌作用；轉(zhuǎn)染circ_0081664抑制表達載體后，A549細(xì)胞的活性降低，Ki-67、Bcl2、MMP-2、MMP-9表達水平降低，P21、Bax表達水平升高，細(xì)胞凋亡率升高，遷移侵襲細(xì)胞數(shù)減少；表明抑制circ_0081664表達可抑制A549細(xì)胞增殖、遷移侵襲，且促進細(xì)胞凋亡。

miR-1205是一種miRNA，位于chr8:(127960633-127960695)，研究表明miR-1205可促進肺腺癌及前列腺癌細(xì)胞生長[13-14]。本實驗結(jié)果顯示，肺癌組織中miR-1205表達水平降低，提示miR-1205可能在肺癌中起抑癌作用。miR-1205過表達后A549細(xì)胞活性降低，Ki-67、Bcl2、MMP-2、MMP-9表達水平降低，P21、Bax表達水平升高，細(xì)胞凋亡率升高，遷移侵襲細(xì)胞數(shù)減少；表明miR-1205過表達可抑制A549細(xì)胞增殖、遷移侵襲，且促進細(xì)胞凋亡。此外，研究報道circRNA可通過調(diào)控miRNA影響腫瘤的進展，如circ_0039411通過miR-1205 / MTA1通路促進甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的生長，遷移和侵襲[15]。circ_0034642通過調(diào)節(jié)miR-1205/S100A8軸促進膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，遷移和侵襲能力并抑制細(xì)胞凋亡[16]。circ_0002052過表達，通過調(diào)節(jié)miR-1205/APC2軸顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲，同時促進了細(xì)胞凋亡[17]。此外，本實驗還發(fā)現(xiàn)circ_0081664靶向調(diào)控miR-1205，同時抑制circ_0081664和miR-1205表達后，細(xì)胞活性升高，細(xì)胞凋亡率降低，遷移侵襲細(xì)胞數(shù)增加；表明miR-1205可影響circ_0081664對肺癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響。

綜上所述，抑制circ_0081664表達可能通過上調(diào)miR-1205抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。