張環(huán) 陶小根

肺孢子菌肺炎(pneumocystis jirovecii pneumonia，PCP)是HIV感染者常見的機會性感染。近年來由于器官移植技術(shù)的發(fā)展、惡性腫瘤患者的不斷增多以及糖皮質(zhì)激素/免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，PCP在免疫功能低下的HIV陰性患者中的發(fā)病率逐漸上升[1]。部分HIV陰性PCP可迅速進展為重癥肺炎，引起不可逆的呼吸衰竭，病死率可達26%～64%[2]。中性粒細胞是機體先天免疫的重要成分，其表面黏附分子CD11b與CD62L是中性粒細胞活化的標(biāo)志物，介導(dǎo)中性粒細胞與內(nèi)皮細胞的黏附，促使中性粒細胞向炎癥處聚集。NETs是中性粒細胞在各種刺激下活化，細胞核內(nèi)DNA及抗菌顆粒蛋白等物質(zhì)釋放到胞外所形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[3]。NETs可通過殺滅病原體而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，但過度釋放可加重炎癥反應(yīng)導(dǎo)致周圍組織損傷。本研究旨在探討NETs水平、中性粒細胞表面黏附分子CD11b、CD62L表達以及APACHE Ⅱ評分對HIV陰性PCP患者預(yù)后的預(yù)測價值。

資料與方法

一、一般資料

選取2018年6月至2020年12月間在中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)住院的60例HIV陰性PCP患者，診斷依據(jù)2016年第五屆歐洲白血病感染會議(ECIL)制定的血液病/惡性腫瘤患者和干細胞移植受者肺孢子菌肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]：新發(fā)的呼吸道癥狀；胸部影像學(xué)可見新發(fā)的肺泡浸潤影或彌漫性磨玻璃影；痰液或支氣管肺泡灌洗液(BALF)六胺銀染色發(fā)現(xiàn)肺孢子菌包囊和/或肺孢子菌DNA陽性。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合PCP診斷標(biāo)準(zhǔn)；年齡≥18周歲；HIV檢測結(jié)果陰性者；臨床資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：HIV/AIDS患者；合并有肺孢子菌之外其他真菌感染者；重要數(shù)據(jù)缺失者；隨訪缺失者；已常規(guī)用藥預(yù)防者。依據(jù)ECIL指南進行規(guī)范化治療[5]，足量應(yīng)用復(fù)方磺胺甲噁唑，根據(jù)臨床療效及時聯(lián)合克林霉素或卡泊芬凈治療，依據(jù)病情需要，采用機械通氣或血液凈化治療。根據(jù)患者住院28d預(yù)后結(jié)局分為存活組(38例) 、死亡組( 22 例) 。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(2020KY倫審第228號)，研究對象或家屬簽署知情同意書 。

二、方法

1. 血指標(biāo)測定:分別于治療前收集外周靜脈血2mL，全自動血細胞分析儀(Sysmex,日本)測定檢測白細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)、淋巴細胞計數(shù)；同時收集靜脈血5mL，進行離心處理后獲得上清液，分別應(yīng)用免疫比濁法、放射免疫學(xué)分析法測定患者C反應(yīng)蛋白(CRP)及降鈣素原(PCT)水平。剩余血標(biāo)本用于后續(xù)指標(biāo)檢測。

2. 中性粒細胞表面黏附分子CD11b、CD62L檢測: 采集各組外周血1mL加入EDTA抗凝管，用人中性粒細胞分離試劑盒(北京索萊寶公司)提取中性粒細胞后重懸細胞，分別加入BV421抗CD62L(美國BD公司)，BV510抗CD11b(美國Biolegend公司)流式細胞抗體0.5ul，混勻轉(zhuǎn)管后行流式細胞儀檢測。流式細胞術(shù)分析采用流式細胞儀軟件(美國新澤西州富蘭克林湖生物科學(xué)中心)。

3. cf-DNA/NETs檢測: 使用PicoGreen dsDNA Quantitation Kits(美國Invitrogen公司)測定：①采集外周靜脈血1mL，離心后取上清至于-20℃保存；②用TE緩沖液將PicoGreen稀釋成1×染料工作液避光儲存?zhèn)溆茫虎壑谱鳂?biāo)準(zhǔn)曲線：用TE工作液將100ug/mLDNA儲存液稀釋成2ug/mL DNA標(biāo)準(zhǔn)品工作液，按照濃度依次為1000、100、10、1、0ng/mL倍比稀釋各梯度標(biāo)準(zhǔn)品溶液，將標(biāo)準(zhǔn)品溶液與PicoGreen 熒光染料工作液室溫避光孵育5min后用熒光酶標(biāo)儀檢測各梯度標(biāo)準(zhǔn)品熒光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的熒光值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；④將待測樣本血清50ul與PicoGreen 熒光染料工作液100ul避光孵育5min后熒光酶標(biāo)儀檢測各樣本熒光值；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本cf-DNA/NETs水平。

4. 采用APACHE Ⅱ評分系統(tǒng)評估PCP患者病情: 入院24h內(nèi)采用 APACHE Ⅱ評分評估患者病情。APACHE Ⅱ評分系統(tǒng)包括3個部分: 急性生理評分、慢性健康評分、年齡評分，總分71分。分值越高，對應(yīng)病情越嚴重。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、存活組、死亡組一般資料比較

存活組與死亡組性別、年齡、基礎(chǔ)疾病、是否使用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑、住院激素使用情況、白細胞計數(shù)、CRP水平均無顯著差異(P>0.05)，死亡組中性粒細胞計數(shù)、PCT水平、APACHEII評分高于存活組，淋巴細胞計數(shù)低于存活組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。

表1 一般資料及入院24h內(nèi)相關(guān)指標(biāo)

二、存活組與死亡組中性粒細胞表型的表達

檢測兩組PCP患者外周血中性粒細胞表面CD62L和CDllb分子MFI的表達。死亡組外周血白細胞(PBNs)活化指標(biāo)CD11b高于存活組，熒光強度分別為(11681.23±1882.45.vs. 9435.26±1224.01；P<0.001)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖1A,C)，CD62L兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見圖1B,D)。

圖1 兩組PCP患者PBNs CDllb、CD62L表達的比較(***P<0.001，有統(tǒng)計學(xué)意義；ns：P=0.146，差異無統(tǒng)計學(xué)意義)

三、存活組、死亡組血漿cf-DNA/NETs水平

死亡組cf-DNA/NETs含量高于存活組，分別為(2282.50±458.38ng/mL .vs. 1497.05±466.15ng/mL；P<0.001)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖2)。

四、預(yù)后相關(guān)影響因素分析

以患者預(yù)后作為因變量(賦值方法：存活=1，死亡=0)，將CD11b、cf-DNA/NET水平按四分位數(shù)間距轉(zhuǎn)換為四分類變量資料，二元Logistic回歸分析在相互校正單因素分析有意義的指標(biāo)后，結(jié)果顯示CD11b、cf-DNA、APACHE Ⅱ評分每增加一個單位，死亡風(fēng)險分別增加138.5%(P=0.019)、166.7%(P=0.011)和35.6%(P=0.002)，而淋巴細胞每增加一個單位，死亡風(fēng)險降低77.%(P=0.004)(見表2)。

表2 相關(guān)因素對預(yù)后的預(yù)測價值

五、相關(guān)影響因素對患者預(yù)后的效能比較

CD11b聯(lián)合cf-DNA的ROC曲線下面積(area under ROC curve，AUC)大于單獨使用CD11b、cf-DNA或APACHE Ⅱ評分，提示聯(lián)合檢測的預(yù)測價值較大，敏感度為95.5%，特異度為89.5%。(見圖3、表3)。

表3 各指標(biāo)對PCP患者28d預(yù)后的預(yù)測價值

圖3 各指標(biāo)預(yù)測PCP患者28d預(yù)后的ROC曲線

討 論

發(fā)生在HIV陰性免疫低下人群的肺孢子菌肺炎常伴有病情重、病死率高等特點，造成了嚴重的社會經(jīng)濟負擔(dān)，探尋其預(yù)后影響因素具有重要的臨床意義。APACHE Ⅱ評分是臨床常用于評估病情嚴重程度的評分方法，可通過估計病死率來預(yù)測患者預(yù)后。既往研究發(fā)現(xiàn)APACHE Ⅱ評分與HIV陰性PCP患者的預(yù)后密切相關(guān)[6]，在本研究中我們也得出了類似的結(jié)果，Logistic分析還提示APACHE Ⅱ評分每升高1分，患者死亡風(fēng)險增加35.6%。

中性粒細胞在受到病原微生物刺激后能夠通過釋放NETs來殺滅病原體，但過度的NETs也可以造成周圍組織的損傷，目前已被證實NETs可能參與了多種肺部疾病的發(fā)生發(fā)展過程，如重癥肺炎、COVID-19、ARDS等[7-9]。Gaborit等[10]曾發(fā)現(xiàn)PCP患者中性粒細胞計數(shù)的升高，但未進一步報道NETs在PCP中的變化。本研究通過測定外周血cf-DNA/NETs濃度，發(fā)現(xiàn)HIV陰性PCP患者外周血中NETs水平顯著增高，這與在其他肺部疾病中觀察到的結(jié)構(gòu)類似[7-9,11]。通過回歸分析還發(fā)現(xiàn)cf-DNA/NETs與預(yù)后相關(guān)，可作為患者預(yù)后的預(yù)測因素，其靈敏度及特異度均較好。我們推測NETs的增高可能由孢子菌在肺內(nèi)產(chǎn)生的細胞免疫反應(yīng)引起中性粒細胞聚集所導(dǎo)致，但過度的NETs直接導(dǎo)致肺泡上皮細胞和毛細血管內(nèi)皮細胞的損傷，NETs水平越高，其損傷程度越重，死亡風(fēng)險越高。

本研究通過對比患者資料發(fā)現(xiàn)，PCP患者淋巴細胞計數(shù)低于參考范圍，且死亡組較存活組更低，與既往報道結(jié)果類似[12]，淋巴細胞作為體內(nèi)主要的免疫細胞，其總數(shù)的減少也反映了機體細胞免疫功能的減退，而且初始淋巴細胞的減低是PCP患者死亡的獨立危險因素[13]。當(dāng)細胞免疫功能受損時，巨噬細胞及T細胞免疫缺陷，機體無法將孢子菌由肺泡內(nèi)清除，巨噬細胞也無法清除過多的NETs，也可能導(dǎo)致NETs的異常增多。

CD11b是一種選擇性表達于白細胞表面的黏附分子，能夠使中性粒細胞由血管內(nèi)皮細胞游出，向炎癥部位聚集，被認為是中性粒細胞活化的標(biāo)志[14]，也是疾病預(yù)后的不良因素[15]。本研究中，我們觀察到在HIV陰性PCP患者中CD11b的表達顯著增高，與在VAP患者中觀察到的變化一致[16],但該試驗未進一步探討其與預(yù)后的關(guān)系，我們的研究對比了死亡組和存活組CD11b表達水平，顯示死亡組CD11b表達更多。CD11b的高表達更有利于中性粒細胞的滲出、聚集[17]，從而釋放更多的NETs，組織損傷進一步加重，ROC曲線提示CD11b可作為患者預(yù)后的獨立預(yù)測因素。

本研究由于標(biāo)本量有限，結(jié)果可能存在偏倚，而且部分病例依賴PC-DNA診斷，可能存在假陽性結(jié)果，同時我們也未對HIV陰性PCP患者體內(nèi)中性粒細胞凋亡和清除標(biāo)志物作進一步檢測，無法了解到NETs對PCP患者的中性粒細胞凋亡的影響，相關(guān)情況仍有待后續(xù)進一步觀察。

綜上，APACHE Ⅱ評分、CD11b、cf-DNA/NETs對HIV陰性PCP患者預(yù)后有一定預(yù)測價值，其中CD11b+cf-DNA聯(lián)合預(yù)測效能最佳。