賈世棟，楊 浩,宋百靈，張春子，毛旭文,4

（1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，2新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院藥學(xué)部，3埃樂(lè)欣藥業(yè)有限公司，4天然藥物活性組分與釋藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830011）

大蒜（Allium sativumL.）為百合科蔥屬植物的根莖，其主要化學(xué)成分為蒜氨酸，含量占0.5%～2.0%。蒜氨酸與蒜酶在碾碎時(shí)接觸，快速反應(yīng)產(chǎn)生大蒜辣素[1]。大蒜具有多種藥理活性，能夠明顯殺滅或抑制細(xì)菌、真菌、病毒，如：痢疾桿菌、傷寒桿菌、白色念珠菌、流感病毒、牛痘病毒等[2-3]。除此以外，大蒜還具有保護(hù)心血管系統(tǒng)[4]、調(diào)節(jié)血糖水平[5]、緩解疲勞[6]、抗腫瘤[7]等藥理活性；雖然國(guó)內(nèi)外對(duì)大蒜的研究日趨增多，但是關(guān)于大蒜對(duì)腸道菌群的益生作用還鮮有報(bào)道。新疆生產(chǎn)的大蒜優(yōu)質(zhì)個(gè)大，生物活性成份含量較高，為大蒜制劑提供了優(yōu)良原料。本文采用菌落計(jì)數(shù)法探究健康小鼠灌胃蒜氨酸、大蒜辣素、大蒜粉前后腸道菌群變化，評(píng)價(jià)大蒜提取物的潛在益生元特性，現(xiàn)報(bào)到如下。

1 材料與方法

1.1 儀器MLS-3750型高壓蒸汽滅菌器（韓國(guó)SANYO公司），AC-S型潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），DNP-9082型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），E200型厭氧培養(yǎng)箱（美國(guó)Gene Sciense公司）。

1.2 試藥伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：1012105），BBL瓊脂培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：100315），LBS瓊脂培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：100929），TSC瓊脂培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：1009032），改良GAM瓊脂培養(yǎng)基廠家（青島海博生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：1009032），疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：1003251），蒜氨酸（新疆埃樂(lè)欣藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20090101，純度84.88%），蒜酶（新疆埃樂(lè)欣藥業(yè)有限公司，批號(hào)：201801003），凍干蒜粉（新疆埃樂(lè)欣藥業(yè)有限公司，批號(hào)：Y201811001）。

1.3 動(dòng)物選取SPF級(jí)C57BL/6J小鼠100只（購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)1140700321501，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006），雌雄對(duì)半，6～8周齡，體質(zhì)量22～25 g。SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（新）2016-0002，光照12 h/d，黑暗12 h/d，溫度（21±2）℃，濕度（40%～45%）。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組及給藥 SPF級(jí)C57BL/6J小鼠隨機(jī)分成10組：空白對(duì)照組（灌胃蒸餾水，灌胃劑量0.1 mL/10g體質(zhì)量），蒜氨酸低（0.0004 3 mg/g體質(zhì)量）、中（0.008 6 mg/g體質(zhì)量）、高（0.017 2 mg/g體質(zhì)量）劑量組，大蒜辣素低（0.001 9 mg/g體質(zhì)量）、中（0.003 9 mg/g體質(zhì)量）、高（0.007 8 mg/g體質(zhì)量）劑量組，大蒜粉低（0.110 8 mg/g體質(zhì)量）、中（0.221 6 mg/g體質(zhì)量）、高（0.443 2 mg/g體質(zhì)量）劑量組，，每組10只。以不同濃度的蒜氨酸、大蒜辣素、大蒜粉溶液灌胃，灌胃劑量0.1 mL/10 g，1次/d，連續(xù)給予30 d。

1.4.2 靶標(biāo)菌培養(yǎng) 收集各組小鼠給藥前后新鮮糞便于滅菌收集EP管中，稱(chēng)取糞便，加生理鹽水，糞便重量與生理鹽水配比為0.1 g:2 mL，立即將EP管封口，渦旋混勻5 min。將糞便混懸液10倍系列稀釋10 000倍，接種于培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，培養(yǎng)基種類(lèi)及其培養(yǎng)條件，見(jiàn)表1。

表1 細(xì)菌培養(yǎng)基種類(lèi)及其培養(yǎng)條件

1.5 指標(biāo)的測(cè)定

1.5.1 體質(zhì)量的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)期間每天同一時(shí)間測(cè)定小鼠體質(zhì)量。

1.5.2 靶標(biāo)菌菌落計(jì)數(shù) 將培養(yǎng)好的細(xì)菌經(jīng)16sRNA測(cè)序鑒定后，計(jì)算每克糞便中細(xì)菌數(shù)量CFU/g=X/0.05×稀釋倍數(shù)/標(biāo)本質(zhì)量（g）。式中X同一稀釋度平均菌落數(shù)。結(jié)果用常用對(duì)數(shù)值Lg CFU/g表示。

1.5.3 K-B紙片擴(kuò)散法體外抑菌實(shí)驗(yàn) 挑取少量上述5種菌培養(yǎng)基，用平板劃線法在MRS固體培養(yǎng)基平板上劃線分離純化菌種。取直徑為6 mm的滅菌濾紙片，放入不同濃度的大蒜提物溶液中浸泡12 h，取出后放至無(wú)菌平皿中風(fēng)干備用。挑取培養(yǎng)基上分離純化后的單個(gè)菌落溶于生理鹽水中，制成0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙骸Ｎ?00μL菌懸液/板，接種于MRS固體培養(yǎng)基。用無(wú)菌鑷子取紙片緊貼于培養(yǎng)皿表面。每個(gè)平板等距離貼3片，每組3個(gè)平行樣。將貼好紙片的培養(yǎng)皿置于37℃溫箱孵育24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌環(huán)的直徑，抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見(jiàn)不到細(xì)菌明顯生長(zhǎng)為限，根據(jù)抑菌環(huán)直徑大小、《紙片法抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)（WS/T125-1999）》[8]判斷細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性，試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑等于0 mm為不敏；小于10 mm為低敏；在10～14 mm之間為中敏；在15～20 mm之間為高敏；大于20 mm，為極敏。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大蒜提取物對(duì)小鼠體質(zhì)量影響與空白對(duì)照組比較，蒜氨酸低、中、高劑量組灌胃第2、3、4周后體質(zhì)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與空白對(duì)照組比較，大蒜辣素低、中、高劑量組灌胃第2、3、4周后體質(zhì)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與空白對(duì)照組比較，大蒜粉低、中、高劑量組灌胃第2、3、4周后體質(zhì)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2～4。

表2 蒜氨酸干預(yù)后小鼠在28 d內(nèi)的體質(zhì)量的變化（±s，g）

表2 蒜氨酸干預(yù)后小鼠在28 d內(nèi)的體質(zhì)量的變化（±s，g）

注：與空白對(duì)照組比較,*P<0.05，**P<0.01。

時(shí)間/周1 2 3 4 總和空白對(duì)照組170.31±8.92 172.52±8.78 172.83±8.51 174.41±8.29 690.06±33.66蒜氨酸低劑量組171.89±5.26 168.18±8.22 164.64±12.26 161.32±12.48*666.02±36.06蒜氨酸中劑量組168.39±6.86 165.03±7.76 162.86±5.92*160.02±5.28**656.29±24.90*蒜氨酸高劑量組163.03±9.47 157.61±11.26*154.98±10.86**151.52±10.78**627.13±39.59**

表3 大蒜辣素干預(yù)后小鼠在28 d內(nèi)的體質(zhì)量的變化（±s，g）

表3 大蒜辣素干預(yù)后小鼠在28 d內(nèi)的體質(zhì)量的變化（±s，g）

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

時(shí)間/周1 2 3 4 總和空白對(duì)照組170.31±8.92 172.52±8.78 172.83±8.51 174.41±8.29 690.06±33.66大蒜辣素低劑量組169.09±6.53 165.24±7.66 163.52±5.63*160.76±5.63**658.60±23.80大蒜辣素中劑量組164.08±7.05 156.21±9.39**154.42±8.67**152.39±8.70**627.10±32.66**大蒜辣素高劑量組166.88±6.20 157.12±10.85**154.91±10.43**152.29±9.97**631.19±37.22**

表4 大蒜粉干預(yù)后小鼠在28 d內(nèi)體質(zhì)量的變化（±s,g）

表4 大蒜粉干預(yù)后小鼠在28 d內(nèi)體質(zhì)量的變化（±s,g）

注：與空白對(duì)照組比較,*P<0.05，**P<0.01。

時(shí)間/周1 2 3 4 總和空白對(duì)照組170.31±8.92 172.52±8.78 172.83±8.51 174.41±8.29 690.06±33.66大蒜粉低劑量組169.51±9.33 163.77±13.36 159.74±12.30*155.65±11.18**648.66±45.83大蒜粉中劑量組165.27±9.97 158.76±13.30*150.82±14.37**144.03±16.14**618.87±51.69**大蒜粉高劑量組169.93±6.87 165.87±7.08 161.21±5.91**157.19±6.25**654.19±22.09

2.2 靶標(biāo)菌菌落計(jì)數(shù)與空白對(duì)照組比較，蒜氨酸低、中、高劑量組乳桿菌、雙歧桿菌數(shù)量明顯增加，產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。灌胃30 d前后自身比較，蒜氨酸低、中、高劑量組乳桿菌、雙歧桿菌數(shù)量明顯增加，產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與空白對(duì)照組比較，大蒜辣素低、中、高劑量組乳桿菌、雙歧桿菌數(shù)量明顯增加，產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。灌胃30 d前后自身比較，大蒜辣素低、中、高劑量組乳桿菌、雙歧桿菌數(shù)量明顯增加，產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與空白對(duì)照組比較，大蒜粉低、中、高劑量組乳桿菌、雙歧桿菌數(shù)量明顯增加，產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。灌胃30 d前后自身比較，大蒜粉低、中、高劑量組乳桿菌、雙歧桿菌數(shù)量明顯增加，產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）,見(jiàn)表5～7。

表5 灌服蒜氨酸前后小鼠腸道5種菌落計(jì)數(shù)（Log CFU，±s）

表5 灌服蒜氨酸前后小鼠腸道5種菌落計(jì)數(shù)（Log CFU，±s）

注：與給藥后對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與本組給藥前相比，#P<0.05，##P<0.01。

菌種乳桿菌雙歧桿菌腸桿菌腸球菌產(chǎn)氣莢膜梭菌空白對(duì)照組灌服前7.88±0.23 8.90±0.24 7.49±0.33 7.18±0.34 7.05±0.33灌服后7.88±0.14 8.82±0.21 7.54±0.10 7.17±0.17 7.07±0.20低劑量組灌服前7.80±0.16 8.81±0.17 7.42±0.29 7.14±0.28 6.99±0.26灌服后8.33±0.15**##9.39±0.17**##7.56±0.18 7.20±0.32 6.37±0.31**##中劑量組灌服前7.85±0.20 8.86±0.20 7.47±0.22 7.03±0.40 7.05±0.22灌服后8.29±0.21**##9.36±0.15**##7.53±0.25 7.22±0.20 6.32±0.29**##高劑量組灌服前7.78±0.29 8.81±0.30 7.41±0.32 7.01±0.42 6.99±0.31灌服后8.35±0.22**##9.43±0.17**##7.59±0.14 7.17±0.41 6.45±0.23**##

表6 灌服大蒜辣素前后小鼠腸道5種菌落計(jì)數(shù)（Log CFU，±s）

表6 灌服大蒜辣素前后小鼠腸道5種菌落計(jì)數(shù)（Log CFU，±s）

注：與給藥后對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與本組給藥前相比，#P<0.05，##P<0.01。

菌種乳桿菌雙歧桿菌腸桿菌腸球菌產(chǎn)氣莢膜梭菌空白對(duì)照組灌服前7.88±0.23 8.90±0.24 7.49±0.33 7.18±0.34 7.05±0.33灌服后7.95±0.10 8.99±0.10 7.61±0.20 7.10±0.48 7.15±0.19低劑量組灌服前7.83±0.20 8.84±0.23 7.46±0.33 7.06±0.36 7.04±0.32灌服后8.27±0.10**##9.33±0.12**##7.52±0.18 7.18±0.28 6.18±0.40**##中劑量組灌服前7.71±0.28 8.72±0.28 7.35±0.39 7.09±0.26 6.91±0.35灌服后8.27±0.17**##9.32±0.17**##7.51±0.12 7.18±0.25 6.37±0.35**##高劑量組灌服前7.78±0.14 8.80±0.10 7.38±0.33 7.08±0.32 7.02±0.19灌服后8.36±0.11**##9.42±0.09**##7.61±0.12 7.30±0.15 6.35±0.40**##

表7 灌服大蒜粉前后小鼠腸道5種菌落計(jì)數(shù)（Log CFU，±s）

表7 灌服大蒜粉前后小鼠腸道5種菌落計(jì)數(shù)（Log CFU，±s）

注：與給藥后對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與本組給藥前相比，#P<0.05，##P<0.01。

菌種乳桿菌雙歧桿菌腸桿菌腸球菌產(chǎn)氣莢膜梭菌空白對(duì)照組灌服前7.88±0.23 8.90±0.24 7.49±0.33 7.18±0.34 7.05±0.33灌服后7.95±0.10 8.99±0.10 7.61±0.20 7.10±0.48 7.15±0.19低劑量組灌服前7.88±0.23 8.89±0.23 7.47±0.32 7.20±0.44 7.16±0.28灌服后8.33±0.14**##9.40±0.15**##7.58±0.23 7.18±0.27 6.39±0.31**##中劑量組灌服前7.83±0.20 8.87±0.18 7.42±0.30 7.05±0.34 7.06±0.22灌服后8.34±0.17**##9.41±0.16**##7.59±0.26 7.25±0.24 6.30±0.34**##高劑量組灌服前7.78±0.21 8.83±0.17 7.44±0.26 7.13±0.29 7.01±0.24灌服后8.43±0.18**##9.50±0.18**##7.67±0.20 7.32±0.29 6.30±0.43**##

2.3 大蒜提取物對(duì)5種菌的體外抑菌作用腸球菌對(duì)低、中、高劑量蒜氨酸均為低敏；產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)低、中、高劑量蒜氨酸均為低敏；乳桿菌、雙歧桿菌、腸桿菌對(duì)低、中、高劑量蒜氨酸均不敏。乳桿菌對(duì)低、中、高劑量大蒜辣素分別為低敏、中敏、高敏；產(chǎn)氣莢膜梭菌、腸桿菌對(duì)低劑量大蒜辣素為低敏，對(duì)中劑量、高劑量大蒜辣素均為中敏；腸球菌對(duì)低劑量大蒜辣素為中敏，對(duì)中劑量、高劑量大蒜辣素均為高敏；雙歧桿菌對(duì)低、中、高劑量大蒜辣素為不敏。乳桿菌對(duì)低劑量、中劑量大蒜粉為中敏，對(duì)高劑量大蒜粉為高敏；腸桿菌對(duì)低劑量、中劑量大蒜粉均為低敏，對(duì)高劑量大蒜粉為中敏；腸球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌大蒜粉低、中、高劑量均為低敏。雙歧桿菌對(duì)低、中、高劑量大蒜粉為不敏，見(jiàn)表8～10。

表8 蒜氨酸抑菌圈直徑/mm

表9 大蒜辣素抑菌圈直徑/mm

表10 大蒜粉抑菌圈直徑/mm

3 討論

人體腸道菌群中雙歧桿菌、乳桿菌是有益菌的代表，通過(guò)降低腸道內(nèi)環(huán)境的pH值、抑制有害菌增殖而發(fā)揮作用[5]。產(chǎn)氣莢膜梭菌是致病菌，能分解肌肉和結(jié)締組織中的糖，產(chǎn)生大量氣體，導(dǎo)致組織嚴(yán)重氣腫，繼而影響血液供應(yīng)，引起氣性壞疽[6]。腸桿菌在相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)被認(rèn)為是非致病菌，直到20世紀(jì)中葉才認(rèn)識(shí)到一些特殊的腸桿菌對(duì)人和動(dòng)物有致病性，常引起嚴(yán)重腹瀉和敗血癥[7]。腸球菌是人類(lèi)和動(dòng)物腸道正常菌群的一部分，以往被認(rèn)為是低毒性的微生物，很少引起致命的感染。近十多年來(lái)，腸球菌引起嚴(yán)重感染，并有較高病死率的報(bào)道不斷增多[8]。產(chǎn)氣莢膜梭菌、雙歧桿菌、乳酸菌、腸球菌和腸桿菌是腸道菌群中較為重要的細(xì)菌種類(lèi)。因此本實(shí)驗(yàn)選用這5種代表菌作為評(píng)價(jià)腸道菌群變化指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)給予小鼠蒜氨酸、大蒜辣素和大蒜粉30天，小鼠體重隨灌胃時(shí)間延長(zhǎng)而下降，初步推測(cè)大蒜及其提取物有減肥功效，后續(xù)將檢測(cè)小鼠血糖、血脂等指標(biāo)。灌胃后與對(duì)照組比較、或與灌胃前自身對(duì)照比較，發(fā)現(xiàn)腸道內(nèi)乳桿菌、雙歧桿菌數(shù)量明顯升高，產(chǎn)氣莢膜梭菌明顯下降，腸球菌、腸桿菌數(shù)量無(wú)變化，說(shuō)明大蒜提取物具有升高有益菌、抑制有害菌生長(zhǎng)，能夠優(yōu)化腸道菌群結(jié)構(gòu)，對(duì)腸道菌群具有有益的調(diào)節(jié)作用。通過(guò)比較低、中、高劑量蒜氨酸對(duì)腸道5種菌的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)不同濃度的蒜氨酸對(duì)腸道菌群作用無(wú)明顯差別，大蒜辣素和大蒜粉對(duì)腸道菌群的作用也同樣無(wú)呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性。均選取高劑量組的蒜氨酸、大蒜辣素、大蒜粉比較對(duì)腸道菌群的益生作用強(qiáng)弱，發(fā)現(xiàn)三種受試物對(duì)腸道菌群的益生作用無(wú)明顯差異。說(shuō)明不同濃度的蒜氨酸、大蒜辣素、大蒜粉調(diào)節(jié)腸道菌群作用強(qiáng)弱無(wú)明顯差別。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)與體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較，大蒜辣素、大蒜粉對(duì)腸桿菌、乳桿菌的體外抑菌作用與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反；蒜氨酸、大蒜辣素及大蒜粉對(duì)腸球菌的體外抑菌作用與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反。分析原因有可能是蒜氨酸、大蒜辣素及大蒜粉在體內(nèi)生成代謝產(chǎn)物，造成體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異。腸球菌、腸桿菌是條件致病菌，在健康小鼠體內(nèi)數(shù)量穩(wěn)定，只有在病理狀況下，腸球菌、腸桿菌才會(huì)大量繁殖。體外實(shí)驗(yàn)將腸球菌、腸桿菌在培養(yǎng)皿上大量繁殖，相當(dāng)于模擬了病理?xiàng)l件下腸球菌、腸桿菌的生長(zhǎng)狀況，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)與體外實(shí)驗(yàn)的條件不一致，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致。說(shuō)明了蒜氨酸、大蒜辣素及大蒜粉在病理?xiàng)l件下對(duì)腸球菌、腸桿菌有抑菌作用，在正常條件下，對(duì)腸球菌、腸桿菌無(wú)抑菌作用。大蒜辣素及大蒜粉對(duì)乳桿菌在體外有較強(qiáng)的抑菌作用，而在體內(nèi)使乳桿菌數(shù)量增加，可能是大蒜辣素及大蒜粉在體內(nèi)使致病菌產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量降低，導(dǎo)致有益菌乳桿菌數(shù)量增加，有益菌雙歧桿菌數(shù)量增加也會(huì)促進(jìn)乳桿菌增殖。綜合體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，蒜氨酸、大蒜辣素、大蒜粉對(duì)腸道菌群具有有益的調(diào)節(jié)作用。