李永娟,劉永香,劉 倩,趙俊精,劉國通

(河北省廊坊市人民醫(yī)院1消化科,2針灸科,河北 廊坊 065000)

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是引發(fā)消化性潰瘍、慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）等消化系統(tǒng)疾病的公認因子，Hp感染可引發(fā)胃上皮細胞損傷，改變其增殖及凋亡，導(dǎo)致胃黏膜病變甚至癌變[1-2]。Polo樣激酶1（polo like kinase 1，PLK1）是一種蘇氨酸/絲氨酸激酶，可調(diào)控細胞胞質(zhì)分離、有絲分裂及DNA損傷應(yīng)答等行為，高表達于肺癌、胃癌等多種惡性腫瘤[3-4]。既往研究顯示[5]，PLK1在胃癌干細胞中高表達，且參與胃癌干細胞靜止與活動狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)化及胃癌干細胞的增殖過程。另有研究顯示[6]，靶向抑制PLK1表達可抑制胃癌細胞的增殖和侵襲。因此，推測PLK1可能參與胃癌的發(fā)生和發(fā)展過程。目前，關(guān)于PLK1在CAG癌前病變各階段中的表達變化研究尚少，且其對胃癌細胞惡性行為學(xué)的影響尚不明確。人正常胃黏膜上皮細胞GES-1作為永生化細胞株，因其基本上保留了正常細胞的骨架結(jié)構(gòu)，故是目前較為理想的Hp共培養(yǎng)模型細胞。本研究通過比較PLK1在Hp感染及未感染CAG癌前病變不同階段患者胃黏膜中的表達情況，并采用PLK1抑制劑BI2536干預(yù)Hp與GES-1細胞共培養(yǎng)模型，觀察其對Hp誘導(dǎo)的GES-1細胞增殖、凋亡的影響，為胃癌的臨床防治提供理論依據(jù)。

1 研究對象、材料與方法

1.1 研究對象選取2017年1月-2021年1月在河北省廊坊市人民醫(yī)院接受胃鏡檢查的260例患者，根據(jù)胃黏膜病理檢查分為淺表性胃炎組95例、CAG伴低級別上皮內(nèi)瘤變（L-IN）組70例、CAG伴高級別上皮內(nèi)瘤變（H-IN）組65例、胃癌組30例。淺表性胃炎組男性61例，女性34例，年齡20～74歲，平均（45.27±7.48）歲，病程6個月～18年，平均（4.04±1.53）年；LIN組男性40例，女性30例，年齡22～74歲，平均（46.36±7.32）歲，病程6個月～17.5年，平均（4.89±1.68）年；H-IN組男性39例，女性26例，年齡22～74歲，平均（46.36±7.32）歲，病程6個月～20.5年，平均（5.19±2.68）年；胃癌組男性19例，女性11例，年齡22～71歲，平均（47.41±7.80）歲，病程7個月～20年，平均（5.05±2.74）年。4組性別、年齡、病程臨床資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準（倫理審批號：LFSRMYY-IRB-2019-013），所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 納入、排除標準納入標準：（1）所有患者均符合《中國慢性胃炎共識意見》中相應(yīng)診斷標準[7]，且經(jīng)胃鏡檢查確診；（2）經(jīng)免疫組織化學(xué)染色法及快速尿素酶實驗聯(lián)合檢測為Hp陽性，Hp陰性檢測結(jié)果為Hp陰性[8]；（3）精神正常，可配合完成研究；（4）均簽署知情同意書。排除標準：（1）合并其他部位惡性腫瘤者；（2）糜爛性胃炎、急性胃黏膜病變、出血性胃炎、腐蝕性胃炎者；（3）近6個月使用過抗生素、抗炎藥物、抑酸藥物、益生菌制劑者；（4）合并嚴重心血管疾病、全身性代謝性疾病或肝腎功能不全者；（5）幽門梗阻性疾病者。

1.3 材料人胃上皮細胞GES-1，購于上海淳麥生物科技有限公司；Hp標準菌株NCTC11637，來源于中國疾病預(yù)防控制中心；淺表性胃炎，CAG伴L-IN、CAG伴H-IN、胃癌患者胃黏膜組織，于本院消化內(nèi)鏡中心進行胃鏡檢查時留取，液氮保存。PLK1抑制劑BI2536，純度99.19%，購自北京百奧萊博科技有限公司。

1.4 主要試劑、儀器兔抗人PLK1一抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；二甲基噻唑（dimethylthiazole，MTT）溶液、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液、PI染液（美國Sigma公司）。Glite UV凝膠成像系統(tǒng)（江蘇偉禾生物科技有限公司）；Amnis?ImageStream?X MKⅡ流式細胞儀（德國Luminex公司）。

1.5 方法

1.5.1 實時熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)檢測胃黏膜組織PLK1表達量 取液氮保存的胃黏膜組織，充分剪碎后Trizol法提取組織中總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，產(chǎn)物經(jīng)鑒定后，進行實時熒光定量PCR，按照試劑盒說明書設(shè)定25μL反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq 12.0μL，10μmol/L的上下游引物各1.0μL，cDNA 2 μL，ddH2O 9.0μL；反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性4 min，95℃變性20 s，57℃退火35 s，72℃延伸45 s，重復(fù)38個循環(huán)。以GAPDH為管家基因，用2-△△CT計算PLK1 mRNA表達量。引物序列：PLK1：F:5'-ATGCGTAGTGCTGATGCGTGA-3',R:5'-CGTAGTGCGTGATGCTGATGC-3';GAPDH:F:5'-TAGCGTATGCTGTGATCGT-3',R:5'-GTAGCTGATGCTAACCTGC-3'。

1.5.2 GES-1細胞培養(yǎng) GES-1細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基（含有10%FBS、1%雙抗）及標準環(huán)境（5%CO2、37℃飽和濕度）中。觀察到細胞貼壁80%左右時，經(jīng)0.25%胰蛋白酶（含0.01%EDTA）消化、傳代。

1.5.3 Hp培養(yǎng) 培養(yǎng)于布氏培養(yǎng)基中（含有抗生素混合液與5%脫纖維凍融兔血），燭缸培養(yǎng)3 d（37℃飽和濕度），采用接種環(huán)輕刮培養(yǎng)基上Hp活菌，PBS懸浮，分光光度計測定吸光度，采用DMEM培養(yǎng)基（含有10%FBS、無雙抗）調(diào)整菌液濃度至1×108cfu/mL。在生物安全三級實驗室（BSL-3）操作。

1.5.4 Hp與GES-1細胞共培養(yǎng)、分組、干預(yù) 將GES-1細胞按照2.4×104個/孔接種于96孔板，采用完全隨機化方式分為空白組、對照組、BI2536組，每組設(shè)置5個平行孔?？瞻捉M不做處理，對照組、BI2536組按照細菌∶細胞=1∶50的比例與細菌懸液混合。對照組加入正常DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，BI2536組加入終濃度為20 nmol/L的BI2536S培養(yǎng)。

1.5.5 實時熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)檢測細胞PLK1表達量 取空白組、對照組、BI2536組細胞，總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、反應(yīng)體系及條件設(shè)置方式同1.5.1，以GAPDH為管家基因，用2-△△CT計算PLK1 mRNA表達量。

1.5.6 MTT實驗檢測增殖能力 取各組細胞，在干預(yù)至24、48、72 h時，加入新制備的0.5%MTT溶液，每孔20μL，靜置2 h后棄去上清，加入DMSO溶液，每孔150μL，振蕩25 min使混合完全，靜置2 h后取上清，酶標儀測定A490nm。A值越大，細胞增殖能力越強。所有操作重復(fù)3次，取均值。

1.5.7 Annexin V/PI雙染法檢測凋亡能力 取各組細胞，干預(yù)至48 h時，binding buffer標記液充分洗滌，3 000 r/min離心后棄上清，加入binding buffer標記液重懸，與AnnexinV-FITC 5μL混合均勻，4℃遮光孵育20 min，加入PI染液5μL混合均勻，遮光孵育30 min，流式細胞儀在60 min內(nèi)檢測凋亡率。所有操作重復(fù)3次，取均值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理、分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多樣本計量資料采用方差分析檢驗，以LSD-t檢驗分析兩兩樣本。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CAG癌前病變不同階段患者PLK1表達量比較與淺表性胃炎組和CAG伴L-IN組比較，CAG伴H-IN組及胃癌患者胃黏膜PLK1表達量升高，且胃癌組高于CAG伴H-IN組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；淺表性胃炎組和CAG伴L-IN組比較，胃黏膜PLK1表達量無差異（P>0.05）。見表1。

表1 CAG癌前病變不同階段患者PLK1表達量比較（±s）

表1 CAG癌前病變不同階段患者PLK1表達量比較（±s）

注：與淺表性胃炎組比較，a P<0.05；與CAG伴L-IN組比較，b P<0.05；與CAG伴H-IN組比較，c P<0.05。

組別淺表性胃炎組CAG伴L-IN組CAG伴H-IN組胃癌組F值P n 95 70 65 30 PLK1表達量0.19±0.04 0.20±0.05 0.36±0.05ab 0.95±0.06abc 172.987<0.001

2.2 Hp陰性、Hp陽性CAG癌前病變不同階段患者PLK1表達比較Hp檢測結(jié)果顯示，Hp陽性患者103例（淺表性胃炎組26例、CAG伴L-IN組23例、CAG伴H-IN組33例、胃癌組21例），Hp陰性患者157例（淺表性胃炎組69例、CAG伴L-IN組47例、CAG伴H-IN組32例、胃癌組9例）。Hp陽性CAG患者PLK1表達量為（0.59±0.05），Hp陰性CAG患者的PLK1表達量為（0.21±0.04），與Hp陰性CAG患者比較，Hp陽性CAG患者PLK1表達量顯著升高（t=63.290，P<0.001）。

2.3 Hp陽性CAG癌前病變不同階段患者PLK1表達比較與Hp陽性淺表性胃炎組和CAG伴L-IN組比較，Hp陽性CAG伴H-IN組及胃癌患者胃黏膜PLK1表達量升高，且胃癌組高于CAG伴H-IN組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；淺表性胃炎組和CAG伴L-IN組比較，胃黏膜PLK1表達量無差異（P>0.05）。見表2。

表2 Hp陽性CAG癌前病變不同階段患者PLK1表達量比較（±s）

表2 Hp陽性CAG癌前病變不同階段患者PLK1表達量比較（±s）

注：與淺表性胃炎組比較，a P<0.05；與CAG伴L-IN組比較，b P<0.05；與CAG伴H-IN組比較，c P<0.05。

組別淺表性胃炎組CAG伴L-IN組CAG伴H-IN組胃癌組F值P n 26 23 33 21 PLK表達量0.28±0.04 0.30±0.05 0.57±0.06ab 1.35±0.13abc 997.618<0.001

2.4 空白組、對照組、BI2536組細胞中PLK1表達比較空白組、對照組、BI2536組細胞中PLK1表達量分別為（0.08±0.01）、（0.47±0.06）、（0.24±0.04），與空白組比較，對照組、BI2536組細胞PLK1表達量升高（t=14.337，P<0.001；t=8.677，P<0.001）；與對照組比較，BI2536組細胞PLK1表達量降低（t=7.132，P<0.001）。

2.5 PLK1抑制劑BI2536對GES-1細胞增殖的影響24、48、72 h三個時刻MTT實驗A值組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與空白組比較，對照組24、48、72 h三個時刻MTT實驗A值均降低（P<0.05）；與對照組比較，BI2536組24、48、72 h三個時刻MTT實驗A值均升高（P<0.05）。見表3。

表3 各組24、48、72 h三個時刻MTT實驗A值比較（±s）

表3 各組24、48、72 h三個時刻MTT實驗A值比較（±s）

注：與空白組比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05。

組別空白組對照組BI2536組F值P 24 h 0.51±0.09 0.26±0.04*0.38±0.04#20.752<0.001 48 h 0.62±0.10 0.34±0.05*0.48±0.06#18.261<0.001 72 h 0.74±0.08 0.49±0.06*0.61±0.07#15.738<0.001

2.6 PLK1抑制劑BI2536對GES-1細胞凋亡的影響空白組、對照組、BI2536組細胞凋亡率分別為（30.47±7.44）%、（49.57±7.38）%、（41.29±5.31）%，凋亡率組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與空白組比較，對照組凋亡率升高；與對照組比較，BI2536組凋亡率降低（P<0.05）。見圖1。

圖1 流式細胞儀檢測各組凋亡率

3 討論

胃癌發(fā)生是機體、環(huán)境多種因素綜合作用的結(jié)果，是一個多階段、多因素、多步驟的發(fā)展過程，其演變過程從淺表性胃炎到CAG，后發(fā)展至低級別上皮內(nèi)瘤變和高級別上皮內(nèi)瘤變，直至胃癌，CAG到腸上皮化發(fā)生、低、高級別上皮內(nèi)瘤變作為胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵階段，被稱作癌前病變[9-10]。因此，對該階段進行干預(yù)是預(yù)防胃癌發(fā)生的有效方式。Hp感染可導(dǎo)致胃黏膜上皮細胞增殖與凋亡的失衡，誘發(fā)以生長抑制或增生為主要表現(xiàn)的疾病如CAG、腫瘤等臨床結(jié)局。本研究所選菌株Hp NCTC11637是I型毒力菌株，可同時表達CagA、VacA毒力因子，具有較強毒性，在細菌與細胞比例為1∶50時即可獲取較好的感染效果[11]。PLK1抑制劑BI2536屬于二氫蝶啶酮類化合物，體外細胞實驗已證實其在膠質(zhì)母細胞瘤中表現(xiàn)出較為滿意的抗腫瘤活性，但關(guān)于其對Hp與GES-1共培養(yǎng)模型增殖、凋亡的影響尚少[12]。

細胞異常增殖、凋亡與一系列胃腸疾病的發(fā)生及正常細胞發(fā)生癌性轉(zhuǎn)變密切相關(guān)。Hp感染不僅可直接導(dǎo)致細胞凋亡，其引發(fā)的炎癥反應(yīng)也起到一定的細胞凋亡誘導(dǎo)作用，胃黏膜細胞數(shù)量逐漸減少，形成胃黏膜萎縮、潰瘍。為維持增殖與凋亡的平衡，胃黏膜上皮細胞將發(fā)生代償性增殖，不斷擴大增殖帶，加快細胞更新速率[13-14]。在消化性潰瘍、CAG發(fā)生、發(fā)展的過程中可能發(fā)生細胞過度凋亡但無對應(yīng)細胞加速增殖，在胃癌進程中則可能發(fā)生細胞迅速增殖，而無凋亡增加，顯著增加惡變風(fēng)險。在Hp清除成功的CAG患者中，細胞增殖及凋亡指數(shù)可逐漸恢復(fù)正常[15]。本研究結(jié)果顯示，與淺表性胃炎組和CAG伴L-IN組比較，CAG伴H-IN組及胃癌患者胃黏膜PLK1表達量升高，且胃癌組高于CAG伴H-IN組，Hp陽性患者PLK1表達量高于Hp陰性患者；Hp陽性的淺表性胃炎、CAG伴L-IN、CAG伴H-IN、胃癌患者PLK1表達量依次升高，提示隨癌前病變階段的發(fā)展，PLK1表達逐漸升高，且在Hp陽性患者中更高。

此外，本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，對照組、BI2536組細胞PLK1表達量升高，與對照組比較，BI2536組細胞PLK1表達量降低；對照組24、48、72 h三個時刻MTT實驗A值均低于空白組，凋亡率高于空白組，而BI2536組24、48、72 h三個時刻MTT實驗A值均高于對照組，凋亡率低于對照組，提示Hp對GES-1細胞具有增殖抑制及凋亡促進作用，而PLK1抑制劑BI2536可顯著拮抗該作用。PLK1不僅可通過直接調(diào)控細胞周期引發(fā)其異常增殖，還會與多種抑癌基因發(fā)生作用，參與調(diào)節(jié)細胞惡性轉(zhuǎn)化。磷酸酶及張力蛋白同源物（phosphate and tension homology deleted on chromsometen，PTEN）是重要的抑癌基因，在多種惡性腫瘤如胃癌中均發(fā)生PTEN失活，且其失活受到多層次調(diào)控[16-17]。研究表明[18]，PLK1可誘導(dǎo)PTEN碳尾端位點磷酸化，改變其結(jié)構(gòu)域，使其失去磷酸酶活性，擾亂其對下游基因的調(diào)節(jié)作用，影響細胞功能，從而增加腫瘤易感性。張耀中等[19]在研究PLK1基因?qū)ξ赴┘毎[瘤生物學(xué)行為的影響時發(fā)現(xiàn)，通過轉(zhuǎn)染PLK1 siRNA阻斷其表達，可抑制胃癌的生長和侵襲轉(zhuǎn)移，提示下調(diào)其表達對抑制腫瘤活性具有積極作用。

綜上所述，胃黏膜PLK1表達量在Hp感染的CAG癌前病變進程中逐漸升高，PLK1可作為臨床中胃癌的早期篩檢的潛在指標，具有重要臨床意義。細胞實驗結(jié)果表明，靶向抑制人胃上皮細胞GES-1中PLK1的表達可顯著降低Hp對GES-1細胞增殖和凋亡的抑制作用，進一步為PLK1作為胃癌治療的可靠靶點提供了理論依據(jù)。在下一步的研究中，應(yīng)進一步開展動物體內(nèi)試驗，為本研究結(jié)論提供更多、更充分的理論依據(jù)。