張巖，夏安婷，劉青悅，劉杰，魏翔飛，曲波，姜毓君，王春梅，張莉

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030）

0 引言

DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）的作用下在Cp G二核苷酸的胞嘧啶上添加一個(gè)甲基的過程[1]。DNA甲基化通過抑制轉(zhuǎn)錄因子與基因啟動(dòng)子的結(jié)合，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展上發(fā)揮著重要作用[2-4]。近年來，隨著表觀遺傳學(xué)研究的深入，DNA甲基化在奶牛乳腺發(fā)育與泌乳生物學(xué)中的調(diào)控機(jī)制引起了越來越多研究者的重視[5-6]。乳脂是牛奶中主要的營養(yǎng)物質(zhì)，乳糖是牛奶中主要的碳水化合物，二者決定了奶牛的產(chǎn)奶量及乳品質(zhì)[7]。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)奶牛和低產(chǎn)奶牛的一些泌乳相關(guān)基因啟動(dòng)子甲基化水平存在顯著差異，因此本實(shí)驗(yàn)利用奶牛乳腺上皮細(xì)胞模型來探究DNA甲基化水平對(duì)奶牛乳脂和乳糖合成的影響，以期為泌乳調(diào)控提供研究基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

主要試劑：CK18抗體（Cell Signaling Technology），F(xiàn)ITC標(biāo)記驢抗兔二抗（北京博奧森），胎牛血清，I型膠原酶（Gibco），DMEM-F12培養(yǎng)液（Hyclone），lipofectamineTM3000（Thermo Scientific），Taq DNA聚合酶、Hind III和Kpn I限制性內(nèi)切酶（Takara），RNA微量提取試劑盒（Magen），ReverTar Ace qPCR RT Kit（上海TOYOBO），THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（上海TOYOBO），Bovine milk fat ELISA KIT、Bovine lactose ELISA KIT（上海酶聯(lián)生物），E.Z.N.A.?Endo-Free Plasmid Mini Kit I（美國Omega）。

主要儀器：PCR儀，美國Eppendorf；熒光定量PCR儀，Roche，LightCycle480；M odel 680酶標(biāo)儀，美國IORAD；CO-150型CO2培養(yǎng)箱，美國Eppendorf；DFC280倒置相差顯微鏡，德國Leica；激光共聚焦掃描顯微鏡，德國Leica；TAL-16A臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定

按照本實(shí)驗(yàn)室奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行奶牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定[8]。將體外分離得到的奶牛乳腺組織用胰酶消化得到原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞，在5%CO2、37℃的條件下，使用含有10%血清和100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的DF12培養(yǎng)液貼壁培養(yǎng)。純化后，采用免疫熒光染色法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行角蛋白18的染色鑒定，使用FITC標(biāo)記的熒光二抗標(biāo)記角蛋白18，DAPI標(biāo)記細(xì)胞核。

1.2.2 DNMT 3A過表達(dá)載體的構(gòu)建

采用RNA提取試劑盒提取奶牛乳腺上皮細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中奶牛的DNMT 3A的mRNA序列設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將膠回收產(chǎn)物與pcDNA3.1載體分別使用Hind III和Kpn I進(jìn)行雙酶切，連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序。測(cè)序成功的陽性克隆經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒備用。PCR擴(kuò)增引物如表1所示。表1中下劃線處為Hind III和Kpn I酶切位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)前為保護(hù)堿基。質(zhì)粒提取采用美國Omega無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒，具體操作按照說明書進(jìn)行。

表1 PCR引物序列

1.2.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

將奶牛乳腺上皮細(xì)胞傳至六孔板，當(dāng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞貼壁培養(yǎng)至70%～80%的密度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染?？瞻讓?duì)照組（blank組）、pcDNA3.1空載體組（control組）、DNMT 3A過表達(dá)質(zhì)粒組（pcDNA3.1-DNMT3A組）均按照實(shí)驗(yàn)要求用脂質(zhì)體3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體操作按照說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后在CO2培養(yǎng)箱中（5%CO2，37℃）繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收樣進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 RNA提取與熒光定量PCR

采用RNA提取試劑盒提取奶牛乳腺上皮細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，按照SYBR qPCR試劑盒說明書配制20 uL反應(yīng)體系，使用兩步法進(jìn)行熒光定量PCR，引物序列如表2所示。

表2 熒光定量PCR引物序列

1.2.5 乳糖與乳脂檢測(cè)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，按照乳脂和乳糖試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中乳脂和乳糖的含量。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

使用Graphpad prism統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)至少3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和作圖，組間比較用單因素方差分析，組內(nèi)比較用t檢驗(yàn)并對(duì)多組進(jìn)行了單因素方差分析。P＜0.05（*）表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異，P＜0.01（*）表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的鑒定

奶牛乳腺上皮細(xì)胞經(jīng)分離純化培養(yǎng)后，采用免疫熒光染色法檢測(cè)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的特征蛋白CK18的表達(dá)，結(jié)果如圖1所示，細(xì)胞核被DAPI染成藍(lán)色，CK18呈綠色熒光，說明本研究分離純化后得到的是奶牛乳腺上皮細(xì)胞。

圖1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞角蛋白18的鑒定

2.2 DNMT3A過表達(dá)載體的構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)提取的奶牛乳腺上皮細(xì)胞總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后檢測(cè)結(jié)果如圖2（a）所示，RNA質(zhì)量較好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以上述RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增結(jié)果如圖2（b）所示，獲得的基因片段長(zhǎng)度約為2851 bp，將PCR產(chǎn)物送去測(cè)序。測(cè)序成功后，將PCR產(chǎn)物膠回收與真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）進(jìn)行連接。將得到的重組質(zhì)粒以T7為前引物送去哈爾濱博仕生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNAMAN 7.0軟件分析，結(jié)果證明pcDNA3.1-DNMT3A重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 DNMT3A的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 DNM T3A的mRNA表達(dá)變化

將pcDNA3.1-DNMT 3A重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染奶牛乳腺上皮細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后通過qRT-PCR方法檢測(cè)DNMT3A mRNA的表達(dá)。結(jié)果如圖3所示，與空白對(duì)照組（blank組）相比，pcDNA3.1空載體組（control組）奶牛乳腺上皮細(xì)胞的DNMT3A的mRNA表達(dá)無明顯變化；與空白對(duì)照組（blank組）和pcDNA3.1空載體組（control組）相比，pcDNA3.1-DNMT 3A重組質(zhì)粒組（DNMT3A組）奶牛乳腺上皮細(xì)胞的DNMT3A的mRNA表達(dá)極顯著增加（P<0.01），說明向奶牛乳腺上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染的pcDNA3.1-DNMT 3A重組質(zhì)粒有效的增加了細(xì)胞中甲基化酶DNMT 3A的表達(dá)量，可以進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)分析。

圖3 DCMECs中DNMT3A mRNA的表達(dá)水平變化

2.4 DCMECs中乳糖合成的變化

本研究采用Bovine lactose ELISA KIT繪制乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)樣品中乳糖濃度。結(jié)果如圖4所示，與空白對(duì)照組（blank組）相比，pcDNA3.1空載體組（control組）奶牛乳腺上皮細(xì)胞的乳糖的含量無明顯變化；與空白對(duì)照組（blank組）和pcDNA3.1空載體組（control組）相比，pcDNA3.1-DNMT 3A重組質(zhì)粒組（DNMT3A組）中乳糖的含量顯著降低（P<0.05），說明過表達(dá)DNMT3A后，奶牛乳腺上皮細(xì)胞基因的DNA甲基化水平升高后，引起了乳糖的合成和分泌的降低。

圖4 DCMECs中乳糖合成的變化

2.5 DCMECs中 乳脂合成的變化

本實(shí)驗(yàn)采用Bovine milk fat ELISA KIT繪制乳脂標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)樣品中乳脂濃度。檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，與空白對(duì)照組（blank組）相比，pcDNA3.1空載體組（control組）奶牛乳腺上皮細(xì)胞的乳脂的含量無明顯變化；與空白對(duì)照組（blank組）和pcDNA3.1空載體組（control組）相比，pcDNA3.1-DNMT 3A重組質(zhì)粒組（DNMT 3A組）中乳脂的含量也顯著降低（P<0.05），說明過表達(dá)DNMT 3A后，奶牛乳腺上皮細(xì)胞基因的DNA甲基化水平升高后，也引起了乳脂的合成和分泌降低?？偟膩砜?，DNA甲基化水平升高對(duì)奶牛乳脂和乳糖的合成具有抑制作用。

圖5 DCMECs中乳脂合成的變化

3 討論

DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)最重要的修飾方式之一，近年來受到越來越多的關(guān)注[9]。DNA甲基化主要發(fā)生在Cp G二核苷酸中胞嘧啶的5'端，通常會(huì)抑制基因的轉(zhuǎn)錄[10-11]。Wang等發(fā)現(xiàn)LPS處理牛的子宮內(nèi)膜細(xì)胞，會(huì)降低IL-6和IL-8基因的表達(dá)，而這種變化是由啟動(dòng)子甲基化所引起的[12-13]。奶牛的產(chǎn)奶量受到多種因素的影響，環(huán)境、激素、疾病等都會(huì)對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)量和活性有重要的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而影響泌乳[14]。在奶牛泌乳過程中，如果泌乳相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)發(fā)生改變，則直接會(huì)對(duì)奶牛的產(chǎn)奶量和產(chǎn)乳品質(zhì)等產(chǎn)生重要的影響[15]。Liu等[16]分析了與奶牛產(chǎn)奶量密切相關(guān)的基因EEF1D和RPL8的甲基化變化，發(fā)現(xiàn)干奶期它們的DNA甲基化水平低于泌乳期，另外，有研究表明，大多數(shù)奶牛乳腺炎和基因的DNA甲基化調(diào)節(jié)也密不可分。乳腺炎是奶牛疾病中最為普遍的一種[17]，它會(huì)導(dǎo)致牛奶產(chǎn)量減少，影響乳品質(zhì)，從而導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失[18-19]。Mao等的研究發(fā)現(xiàn)在患有乳腺炎的母牛中，CXCR 1基因的外顯子區(qū)域的Cp G島的90%以上的Cp G位點(diǎn)呈甲基化狀態(tài)[20]。這些研究表明DNA甲基化與奶牛泌乳密切相關(guān)。乳脂是影響牛奶質(zhì)量的主要因素。在乳腺中，乳脂有一半來自于日糧中的脂肪，另外一半則都來源于乳腺上皮細(xì)胞合成[21-23]。乳糖也是決定奶牛產(chǎn)奶量的主要因素，這是由于其滲透壓的特性會(huì)導(dǎo)致乳腺上皮細(xì)胞的高爾基體吸收水分[24-27]。本研究結(jié)果表明，過表達(dá)DNMT 3A后，奶牛乳腺上皮細(xì)胞中乳脂和乳糖的合成減少，這種變化應(yīng)該是與乳脂和乳糖合成的相關(guān)基因的甲基化水平升高引起的，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。本研究為表觀遺傳學(xué)在奶牛泌乳中的調(diào)控作用和機(jī)制研究提供了理論研究基礎(chǔ)，為一些奶牛疾病的機(jī)制研究提供前期研究基礎(chǔ)，從而為提高奶牛泌乳質(zhì)量和泌乳產(chǎn)量服務(wù)。