陳 棒,王 丹,趙 希

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 胃腸內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130021)

胃食管反流病(GERD)是臨床常見(jiàn)病，燒心和反流是其典型癥狀，根據(jù)黏膜損傷程度又進(jìn)一步分為反流性食管炎(RE)，非糜爛性反流病(NERD)及巴雷特食管(BE)[1]。GERD的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前認(rèn)為是多種因素造成的以食管下括約肌功能障礙為主的胃食管動(dòng)力障礙性疾病。而GERD相關(guān)動(dòng)物模型的制備對(duì)于發(fā)病機(jī)制的研究、診斷及篩選治療藥物等方面具有重要的臨床價(jià)值。其中RE因其存在器質(zhì)性病變，易于通過(guò)動(dòng)物模型研究其發(fā)病機(jī)制，故而在有關(guān)GERD的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用較多。本文對(duì)與GERD動(dòng)物模型制備相關(guān)的方法及評(píng)價(jià)綜述如下。

1 建立GERD動(dòng)物模型

目前GERD動(dòng)物模型的制備主要包括三種基本類型：自然模型，外科模型和遺傳模型[2]。自然模型是指通過(guò)外源性灌注化學(xué)反流成分誘導(dǎo)食管炎。外科模型是通過(guò)外科手術(shù)改變動(dòng)物胃腸道自然解剖結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)食管炎，包括胃反流、混合反流、十二指腸反流和食管移植。而遺傳模型則是通過(guò)基因改造而制備的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，常用于巴雷特食管和食管腺癌(EAC)動(dòng)物模型的建立。此外，近年來(lái)通過(guò)內(nèi)鏡干預(yù)如內(nèi)鏡下環(huán)形肌切開(kāi)制備GERD動(dòng)物模型等，為GERD大型動(dòng)物模型制備提供了一種新穎、微創(chuàng)、成功率較高的方法選擇。

1.1 自然模型

自然模型是指通過(guò)外源性食管灌注(EEP)誘導(dǎo)食管炎。食管灌注方法主要用于一些短期制備GERD動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)，是指將食管上皮暴露于某些化學(xué)溶液(如酸、膽鹽、胃蛋白酶等反流物)，控制反流物的濃度和暴露時(shí)間，目的是明確反流液對(duì)食管黏膜的損傷因子及其作用機(jī)制。Li 等[3]設(shè)計(jì)了一種允許持續(xù)輸注測(cè)試物質(zhì)或藥物的長(zhǎng)期給藥方法：在食管上部插管，連接到皮下滲透微泵，通過(guò)手術(shù)放置的插管將膽汁和酸以一定的速率連續(xù)灌注到食管腔，觀察到7d后即可引起RE的組織細(xì)胞學(xué)損傷。王宏偉等[4]通過(guò)混合灌注鹽酸和豬膽汁建立了家兔GERD模型，對(duì)比生理鹽水灌注組，灌注操作后分別對(duì)食管黏膜進(jìn)行肉眼觀察、HE染色光鏡下病理觀察及電鏡下細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察。該實(shí)驗(yàn)操作未破壞動(dòng)物食管、胃、十二指腸的生理解剖結(jié)構(gòu)，在較短時(shí)間內(nèi)成功制備了家兔GERD模型。Pardon等[5]設(shè)計(jì)了一種活體兔食管灌注模型，將55只麻醉家兔，分別用pH7.2、pH5.0[包括含200 μM和500 μM脫氧膽酸(DCA)]、pH1.0的不同溶液灌注食管30 min，然后分別于灌注后即刻、24 h、48 h時(shí)處死動(dòng)物，通過(guò)檢測(cè)食管黏膜細(xì)胞的跨上皮電阻、上皮細(xì)胞間隙擴(kuò)張和細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)含有DCA的弱酸性溶液可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡，并對(duì)黏膜完整性造成長(zhǎng)期損害。此類急性食管灌注建模實(shí)驗(yàn)操作流程相對(duì)簡(jiǎn)單，術(shù)后動(dòng)物存活率高，但由于人體內(nèi)反流物成分復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)灌注成分相對(duì)單一，無(wú)法精確模擬RE形成的自然病理過(guò)程[6]。

1.2 外科模型

手術(shù)制備GERD動(dòng)物模型是通過(guò)胃腸道手術(shù)建立模型，屬于慢性實(shí)驗(yàn)，主要用于明確長(zhǎng)期食管內(nèi)反流的病理變化及發(fā)病機(jī)制，是建立RE、NERD及巴雷特食管模型較為普遍的手段之一。目前主要術(shù)式包括：胃反流、混合反流、十二指腸反流和食管移植等。

1.2.1胃反流 王強(qiáng)等[7]應(yīng)用5月齡新西蘭大白兔先進(jìn)行不潔飲食法和刺激法3周誘導(dǎo)胃排空障礙，3周后使用球囊擴(kuò)張法破壞兔食管下括約肌，設(shè)計(jì)了一種同時(shí)具備食管下段抗反流屏障缺陷以及胃排空功能障礙的新型GERD動(dòng)物模型。Silva等[8]標(biāo)準(zhǔn)化了手術(shù)誘導(dǎo)小鼠NERD的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停涸诳拷拈T的十二指腸周圍放置硅化無(wú)毒環(huán)，以促進(jìn)幽門狹窄，限制胃排空(不完全阻斷十二指腸腔)，并結(jié)扎胃底和胃體之間的過(guò)渡區(qū)，以限制胃的順應(yīng)性，術(shù)后通過(guò)觀察炎癥情況、食管黏膜的完整性、以及使用PPI的效果對(duì)模型進(jìn)行評(píng)估，為NERD相關(guān)的病理生理機(jī)制研究提供了幫助。謝勝等[9]比較了賁門鋼圈置入固定術(shù)(固定鋼圈于鞘管上，沿食管將鋼圈送于賁門處，再用魚線縫合固定)和食管氣囊擴(kuò)張術(shù)兩種建立大鼠反流模型的術(shù)式，兩種術(shù)式均可成功建立大鼠GERD模型，但賁門鋼圈置入固定術(shù)實(shí)驗(yàn)組的大鼠自第二周開(kāi)始出現(xiàn)鋼圈脫落，可能是固定線不耐腐蝕及縫合方式不佳所致，大鼠模型維持時(shí)間短，實(shí)用性差，實(shí)驗(yàn)術(shù)式有待進(jìn)一步改進(jìn)。

1.2.2混合反流 已知的混合反流模型有三種：食管-十二指腸吻合術(shù)(EDA)、食管-空腸吻合術(shù)(esophagus-jejunal anastomosis，EJA)和食管-空腸、胃-空腸吻合術(shù)(EJGJ)[10]。EDA模型是將食管下括約肌與十二指腸起始部(距幽門1 cm)之間進(jìn)行端端吻合，保留迷走神經(jīng)，使胃分泌物與十二指腸分泌物一起經(jīng)吻合口反流入食管，EDA模型可以很好的模擬GERD患者的反流狀態(tài)。然而，在EDA模型中，十二指腸液反流減少，難以誘發(fā)巴雷特食管[11]。EJA模型是在食管下段和空腸起始部之間進(jìn)行端端吻合，并保留迷走神經(jīng)，使所有來(lái)自胃和十二指腸的液體都可以流入食管下段。然而，在EJA模型中，反流太劇烈，不能模擬巴雷特食管患者由慢性胃食管反流誘發(fā)的真實(shí)情況。在EJGJ模型中，胃液從胃排入空腸，與十二指腸液混合流入食管下段，EJGJ模型綜合了EDA和EJA模型模擬人類GERD的病理生理狀態(tài)。

Theisen等[11]采用轉(zhuǎn)基因大鼠通過(guò)食管十二指腸端側(cè)吻合術(shù)誘導(dǎo)十二指腸分泌物向食管的外科分流，然后將每只轉(zhuǎn)基因大鼠暴露在化學(xué)致癌物(如亞硝胺)或十二指腸胃反流中16周，成功構(gòu)建了GERD的EDA動(dòng)物模型，其中亞硝胺處理使乳糖操縱子調(diào)節(jié)基因(LacI)突變頻率增加近20倍，出現(xiàn)的特異性突變明顯高于偶然預(yù)期，并與人類食管腺癌p53突變中發(fā)現(xiàn)的相似，提示反流物與人類食管腺癌的發(fā)生可能有關(guān)。Kanai等[12]在進(jìn)行宿主因素對(duì)巴雷特食管癌變的影響研究中，不切除胃而直接行EJA術(shù)式，構(gòu)建了小鼠、大鼠胃十二指腸反流模型：剖腹后切斷食管胃連接部，將殘胃連續(xù)縫合，在食管斷端和距幽門環(huán)約2 cm的空腸上端之間進(jìn)行端側(cè)吻合。張濤[13]等將75只大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，將實(shí)驗(yàn)組大鼠食管下段切斷，在距離幽門0.5 cm位置處切斷十二指腸，并將十二指腸斷端、食管斷端自空腸起始處依次端-側(cè)吻合至空腸壁上，成功建成EJGJ反流模型，模擬了GERD患者反流性食管炎-巴雷特食管-EAC的整個(gè)發(fā)展過(guò)程。此外，Wen等[10]將EJGJ模型進(jìn)行了優(yōu)化改進(jìn)：延長(zhǎng)胃空腸吻合口和食管空腸吻合口的距離，使胃液與十二指腸液能很好地混合，同時(shí)為避免梗阻，在食管下段將平行切口改為斜切口，增加了食管-空腸吻合口長(zhǎng)度，以上兩種改良方法提高了存活大鼠巴雷特食管的發(fā)生率，并有效降低大鼠因梗阻致死的術(shù)后并發(fā)癥。

1.2.3十二指腸反流模型和食管移植模型 He等[14]和Arcidiacono等[15]在混合反流的基礎(chǔ)上于食管胃連接部切斷并結(jié)扎食管，幽門處切斷并結(jié)扎十二指腸，進(jìn)行空腸-食管端側(cè)吻合，去掉整個(gè)胃，建立了十二指腸反流模型。王瑞華等[16]分別建立了大鼠EDA模型、EJA模型及十二指腸反流模型，術(shù)后觀察大鼠的一般情況和食管病變情況，發(fā)現(xiàn)3種術(shù)式的模型組均出現(xiàn)程度不同的反流性食管炎，其中EJA模型組、EDA模型組食管病變較重，且巴雷特食管發(fā)生率均高于十二指腸反流模型組。王學(xué)偉等[17]采用5種不同術(shù)式建立大鼠食管膽汁反流模型，發(fā)現(xiàn)5種反流模型均能依次導(dǎo)致反流性食管炎-巴雷特食管-巴雷特食管上皮不典型增生和腺癌、或鱗癌和腺-鱗癌，提示反流性食管炎-巴雷特食管-食管腺癌的發(fā)生模式存在，且膽汁反流是病因之一。

巴雷特食管有發(fā)生腺癌的可能，表現(xiàn)為食管下段黏膜的鱗狀上皮細(xì)胞被柱狀上皮細(xì)胞所取代，是GERD的并發(fā)癥。Watanabe等[18]采用8周齡大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，分別將大鼠不同部位的正常黏膜組織移植到大鼠十二指腸中，觀察移植到十二指腸部位的正常組織阿利新藍(lán)PAS染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植到十二指腸部位的正常組織中均可見(jiàn)杯狀細(xì)胞，呈綠色熒光蛋白(GFP)陽(yáng)性，黏蛋白陽(yáng)性，邊緣有堿性磷酸酶活性，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明組織內(nèi)的干細(xì)胞具有多分化潛能，當(dāng)移植到不同的部位時(shí)，可以轉(zhuǎn)分化為該部位相應(yīng)的器官組織。該實(shí)驗(yàn)中，移植到十二指腸壁上的大鼠前胃正常黏膜組織發(fā)生腸化生可能源于鱗狀上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，食管移植實(shí)驗(yàn)對(duì)巴雷特食管起源的研究將提供新的途徑[19]。

1.2.4其他與GERD有關(guān)的研究 Bahadr等[20]研究大鼠腹腔鏡手術(shù)中腹內(nèi)壓(IAP)持續(xù)時(shí)間對(duì)GER的影響時(shí)得出結(jié)論，長(zhǎng)時(shí)間的腹腔鏡手術(shù)可能導(dǎo)致GER。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為今后制備GERD動(dòng)物模型時(shí)提供輔助方法和新思路。

外科模型無(wú)論采用何種術(shù)式，優(yōu)點(diǎn)是建模效率高，接近GERD的解剖學(xué)發(fā)生機(jī)制，適用于病因和發(fā)病機(jī)制研究；但該類方法操作過(guò)程復(fù)雜，創(chuàng)傷大，改變了動(dòng)物生理解剖結(jié)構(gòu)，影響存活率，而且僅強(qiáng)調(diào)影響胃排空障礙的解剖學(xué)改變，無(wú)法模擬其他功能性因素對(duì)食管胃動(dòng)力的改變。熟練的模型制備技巧對(duì)建模成功率至關(guān)重要，在制備過(guò)程中應(yīng)注意：(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前禁食時(shí)長(zhǎng)應(yīng)大于24小時(shí)，保證胃排空，減少術(shù)后腹腔感染;(2)術(shù)中開(kāi)腹后應(yīng)保持消化道通暢，避免扭曲成角;(3)游離下段食管時(shí)避免損傷迷走神經(jīng);(4)注意縫合方式、縫合線種類及線頭留用的長(zhǎng)短，避免吻合口漏或嚴(yán)重出血;(5)為避免術(shù)后腹腔污染嚴(yán)重、增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率，可于術(shù)前預(yù)防性使用抗生素[21]。

1.3 遺傳模型

近年來(lái)通過(guò)基因改變制備GERD模型也開(kāi)始受到關(guān)注，遺傳模型多用于巴雷特食管和食管腺癌動(dòng)物模型的建立。小鼠模型非常適合于分子基因研究，因?yàn)樾∈蠡蚪M已經(jīng)完全測(cè)序，有許多學(xué)者嘗試?yán)棉D(zhuǎn)基因和異種移植小鼠模型來(lái)研究巴雷特食管[2]。Hao等[22]對(duì)野生型p53A135V轉(zhuǎn)基因小鼠和A/J株INK4a/Arf+/-小鼠進(jìn)行反流手術(shù)，其中，一些小鼠還接受奧美拉唑(飲食中加入奧美拉唑的濃度為1400 ppm)、鐵(50 mg/kg/m，注射或口服)或胃切除加鐵的治療，結(jié)果實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有一只小鼠患上食管腺癌，他們的研究認(rèn)為手術(shù)誘導(dǎo)的胃食管反流可導(dǎo)致小鼠食管鱗狀細(xì)胞癌，而不是食管腺癌。抑癌基因p53、p27和p16在人EAC中經(jīng)常發(fā)生突變或丟失。p53-/-和p27-/-小鼠對(duì)手術(shù)誘導(dǎo)的巴雷特食管和EAC更敏感，p16-/-進(jìn)行反流手術(shù)的小鼠只誘導(dǎo)了鱗狀細(xì)胞癌，而不是EAC[19]。目前遺傳模型的研究有限，仍需要更大范圍的驗(yàn)證。

1.4 內(nèi)鏡干預(yù)模型

有研究[23]選用6頭肉豬，采用經(jīng)口內(nèi)鏡下隧道技術(shù)于齒狀線上方5 cm處切開(kāi)食管全層，術(shù)前、術(shù)后均行食管造影，觀察造影劑通過(guò)食管下段時(shí)的阻力變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)食管下段在手術(shù)前后無(wú)明顯縮窄或增寬，術(shù)后造影劑通過(guò)順利，而食管下括約肌張力明顯松弛，從而建立了一種微創(chuàng)、新穎的內(nèi)鏡下GERD大動(dòng)物模型制備方法。Alshehri等[24]通過(guò)切開(kāi)豬食管下括約肌制備GERD模型，并于內(nèi)鏡下注射右旋糖酐透明質(zhì)酸共聚物(DxHA)于食管下括約肌，發(fā)現(xiàn)注射DxHA可引起成纖維細(xì)胞和巨細(xì)胞的異物反應(yīng)，增強(qiáng)食管下括約肌的抗反流屏障功能，對(duì)GERD有潛在的治療作用。

孫賢久等[25]選取健康6-12月齡的實(shí)驗(yàn)犬，通過(guò)內(nèi)鏡下切開(kāi)環(huán)行肌的手術(shù)方法制備GERD模型，觀察比較操作前后7天的食管壓力、食管pH值測(cè)定及處死后光鏡下食管組織病理改變，成功建立了反流模型。該實(shí)驗(yàn)建模成功率較高且不破壞實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的解剖結(jié)構(gòu)，較好地還原了反流性食管炎的病理發(fā)生機(jī)制，可能成為未來(lái)研究?jī)?nèi)鏡下抗反流治療的新型動(dòng)物模型制備方法。

2 模型評(píng)價(jià)

GERD的診斷方式多種，包括癥狀學(xué)診斷、胃鏡檢查[色素內(nèi)鏡、 放大內(nèi)鏡、 窄帶成像(NBI)、共聚焦激光纖維內(nèi)鏡、i-scan 技術(shù)等新顯像模式的特殊內(nèi)鏡]、食管pH監(jiān)測(cè)(24 h食管pH監(jiān)測(cè)、食管阻抗-pH監(jiān)測(cè)以及無(wú)線食管 pH 膠囊監(jiān)測(cè))、質(zhì)子泵抑制劑(PPI)診斷性試驗(yàn)、高分辨率食管測(cè)壓、食管鋇劑造影、胃腸超聲造影、唾液胃蛋白酶原檢測(cè)等[26]。受限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的獨(dú)特性和局限性，目前GERD動(dòng)物模型制備的檢測(cè)方式多采用建模后病理觀察食管黏膜病變，包括肉眼下、HE染色光鏡下、電鏡下等觀察食管黏膜炎性病變，判斷反流建模成功與否。借鑒GERD患者的診斷方式，可以將24 h食管pH監(jiān)測(cè)、食管阻抗-pH監(jiān)測(cè)以及高分辨率食管測(cè)壓等技術(shù)應(yīng)用于GERD動(dòng)物模型制備的監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)中，從而提高對(duì)動(dòng)物模型評(píng)價(jià)的敏感性，減輕食管病理取材對(duì)動(dòng)物的損傷，同時(shí)有助于提高建模成功后動(dòng)物的生存時(shí)間和利用率。

3 理想動(dòng)物模型

目前大多數(shù)GERD模型是通過(guò)人為實(shí)驗(yàn)操作建立的，Glover等[27]報(bào)道了一種可以表現(xiàn)出自然發(fā)生GERD癥狀的已知物種，該實(shí)驗(yàn)收集了8只活檢組織病理診斷為GERD的狒狒進(jìn)行了回顧性研究，分析已知危險(xiǎn)因素對(duì)疾病發(fā)展的影響程度(如飲酒、高脂飲食等)，首次報(bào)道了GERD可以在任何非人類靈長(zhǎng)類物種中自然發(fā)生，并指出狒狒在解剖學(xué)和生理學(xué)上與人類相似，可能是研究GERD的一種較理想的動(dòng)物模型。所謂理想的動(dòng)物模型[2]應(yīng)符合三個(gè)基本標(biāo)準(zhǔn)：(1)與人的遺傳具有相關(guān)性；(2)食管胃連接部的解剖學(xué)與人類相似性；(3)自然發(fā)生病理生理學(xué)導(dǎo)致的GERD。小鼠和人類食管之間的組織學(xué)差異是這些手術(shù)模型的固有局限性。如果用于研究巴雷特食管和食管腺癌，可能需要將反流手術(shù)和基因改造或添加外源性致癌物結(jié)合起來(lái)，以提高建模成功率。

4 結(jié)論

現(xiàn)有GERD動(dòng)物模型制備方式有不同程度的食管病變形成，但任何一種模型都具有內(nèi)在的局限性，需要熟練掌握模型操作技術(shù)，提高建模成功率，降低動(dòng)物術(shù)后死亡率并有效降低成本，同時(shí)選擇更可靠的模型評(píng)估手段如pH監(jiān)測(cè)等方式進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的制備模型方法并提高模型質(zhì)量，開(kāi)發(fā)更簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、有效的造模方法將是今后GERD動(dòng)物模型研究的主要方向。