梁 紅，王奕文，智 玥，宋 楊

(長(zhǎng)春市中心醫(yī)院 呼吸內(nèi)科,吉林 長(zhǎng)春130051)

肺癌是常見(jiàn)肺原發(fā)惡性腫瘤，近年來(lái)隨著EGFR抑制劑等基因靶向藥物的問(wèn)世，肺癌的治療取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。吉非替尼是EGFR-TKI類靶向治療的代表性藥物，是一種口服的選擇性EGFR酪氨酸激酶抑制劑。RBM5作為一個(gè)腫瘤抑制基因，前期研究發(fā)現(xiàn)RBM5與肺癌化療耐藥有關(guān)，可逆轉(zhuǎn)肺腺癌細(xì)胞順鉑耐藥性。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)RBM5過(guò)表達(dá)對(duì)吉非替尼耐藥細(xì)胞EGFR基因表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響，探討RBM5在改善吉非替尼耐藥中的作用，探尋其逆轉(zhuǎn)耐藥機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 細(xì)胞系培養(yǎng)及耐藥細(xì)胞誘導(dǎo)及質(zhì)粒來(lái)源人肺腺癌A549細(xì)胞株由吉林大學(xué)前列腺疾病研究防治中心保存；培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。耐藥細(xì)胞A549/GR采用大劑量沖擊和逐漸增加劑量相結(jié)合的方法誘導(dǎo)產(chǎn)生。大腸桿菌感受態(tài)JM109、減毒沙門(mén)氏菌(attenuated Salmonella enterica)及帶有GFP的 pcDNA3.1表達(dá)載體由吉林大學(xué)前列腺中心保存，含GFP的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-RBM5由澳大利亞惠贈(zèng)。

1.2 質(zhì)粒提取與細(xì)胞培養(yǎng)使用去內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒提取pcDNA3.1-control及pcDNA3.1-RBM5兩組重組質(zhì)粒，儀器定量提取質(zhì)粒濃度和質(zhì)量。吉非替尼耐藥A549/GR細(xì)胞在(無(wú)抗生素)含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。將實(shí)驗(yàn)均分為三組，分別為mock對(duì)照組(單用轉(zhuǎn)染試劑)、control對(duì)照組(轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1)及pRBM5組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-RBM5)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染吉非替尼耐藥A549/GR細(xì)胞，當(dāng)貼壁細(xì)胞達(dá)90%融合度時(shí),進(jìn)行以下操作：(1)制備質(zhì)粒和脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 復(fù)合物。以含血清的培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒，取上述兩種質(zhì)粒DNA各2 μg分別加入各自小瓶中至200 μl，混勻，超凈臺(tái)中靜置5 min，注意不能使用塑料EP管，影響轉(zhuǎn)染效果；取4 μl 轉(zhuǎn)染試劑加入混合液中，混勻，室溫靜置30 min；所有操作嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。(2)將上述復(fù)合物加至待轉(zhuǎn)染的六孔板細(xì)胞培養(yǎng)基中充分混勻，繼續(xù)培養(yǎng)所需要的時(shí)間(24 h，48 h)，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 Westeron blot方法檢測(cè)①蛋白裂解液提取總蛋白并定量。②配置15%聚丙烯酰胺凝膠。③SDS-PAGE電泳。④免疫印跡雜交(Westeron blot)。⑤抗體孵育及顯色。采用GIS凝膠成像分析系統(tǒng)處理，光密度比值確定其含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 17.0.軟件進(jìn)行分析。RBM5、EGFR基因在細(xì)胞中表達(dá)用配對(duì)T檢驗(yàn)方法。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

轉(zhuǎn)染后，A549/GR細(xì)胞中RBM5、EGFR蛋白表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示與mock組及control組相比，在pRBM5組A549/GR細(xì)胞中，RBM5蛋白高表達(dá)，EGFR蛋白表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與mock組相比，control組RBM5、EGFR蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異。結(jié)果提示：在蛋白水平過(guò)表達(dá)RBM5后，會(huì)降低A549/GR細(xì)胞中EGFR蛋白表達(dá)。

圖1 轉(zhuǎn)染后A549/GR細(xì)胞中RBM5、EGFR蛋白表達(dá)結(jié)果

3 討論

自RBM5發(fā)現(xiàn)以來(lái)，其抑癌機(jī)制廣為關(guān)注，研究已經(jīng)證實(shí)RBM5是細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)節(jié)因子，在乳腺癌細(xì)胞CEM-C7和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549中RBM5過(guò)表達(dá)可使細(xì)胞循環(huán)停滯在G1期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖[1-2]。前期研究顯示RBM5與EGFR在A549/GR細(xì)胞中表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，RBM5抑制細(xì)胞增殖可能途徑為RAS/RAF/MAPK/ERK通路。RBM5高表達(dá)后不但降低EGFR、而且還降低其下游途徑中的因子，從多角度及層面進(jìn)一步抑制了細(xì)胞增殖，進(jìn)而抑制肺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移[3]。為進(jìn)一步研究RBM5高表達(dá)對(duì)吉非替尼耐藥細(xì)胞中EGFR基因表達(dá)的影響，應(yīng)用Western blot方法對(duì)pRBM5組，mock組及control組的RBM5、EGFR進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示pRBM5組與mock組及control組相比，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染RBM5高表達(dá)質(zhì)粒后，獲得了A549/GR/RBM5細(xì)胞，其RBM5的高表達(dá)降低了EGFR蛋白表達(dá)((P<0.05))。在倒置相差顯微鏡下，觀察A549/GR細(xì)胞生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染pRBM5成功后，與mock組及control組相比，pRBM5組細(xì)胞形態(tài)皺縮變形，貼壁細(xì)胞數(shù)量減少，漂浮細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞碎片增多，生長(zhǎng)速度緩慢。說(shuō)明轉(zhuǎn)染pRBM5質(zhì)粒后A549/GR細(xì)胞增殖受抑制。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)腫瘤抑制基因RBM5可通過(guò)降低EGFR抑制A549/GR肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。那么RBM5可否逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥A549/GR細(xì)胞耐藥呢，研究組下一步將觀察pRBM5組與control對(duì)照組A549/GR細(xì)胞及A549在吉非替尼作用下增殖情況，研究RBM5在逆轉(zhuǎn)靶向藥物耐藥中的作用，以期解決臨床靶向藥物耐藥問(wèn)題。