姚 遠(yuǎn),任晶紅,劉環(huán)宇,紀(jì)影實(shí)

(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)系，吉林 長春130021)

阿爾茨海默病(AD)的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前尚不清楚[1]。研究發(fā)現(xiàn)，腦衰反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2(CRMP2)與AD的發(fā)生關(guān)系密切。在AD大鼠的海馬和皮層組織中，磷酸化的CRMP2表達(dá)增加[2]。磷酸化的CRMP2與N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDARs)結(jié)合，引起NMDARs的過度激活，導(dǎo)致胞內(nèi)鈣超載，進(jìn)而觸發(fā)下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞功能紊亂[3]。研究證實(shí)，干擾CRMP2與NMDARs的相互作用，具有神經(jīng)保護(hù)作用。CRMP2通過鈣通道結(jié)合域3(CBD3)與NMDARs結(jié)合,然而，CBD3多肽的通透性不佳，難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，影響藥效，通過HIV的穿膜肽TAT與CBD3多肽連接融合即TAT-CBD3多肽，其穿膜能力明顯增強(qiáng)。本研究觀察CRMP2衍生的TAT-CBD3多肽對AD大鼠神經(jīng)元的保護(hù)作用并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器Aβ25-35購于美國Sigma-Aldrich公司，TAT-CBD3由上海耀強(qiáng)生物科技有限公司生產(chǎn)，純度為99%，CRMP2抗體、NMDAR2B抗體、GAPDH抗體、pCRMP2(Ser522)抗體購于Abcam公司，羊抗兔二抗、兔IgG、Protein A+G Agarose購于碧云天生物技術(shù)公司，腦立體定位儀由美國Stoelting公司生產(chǎn)，DMS-2 型Morris 水迷宮系統(tǒng)由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組雄性Wistar大鼠40只，體重280-310 g，購自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，合格證號(hào)為SCXK(吉)2017-0001。大鼠自由進(jìn)食水2周后，隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為假手術(shù)組(Sham)，模型組(Model)，TAT-CBD3低劑量組(TAT-CBD3-L)，TAT-CBD3高劑量組(TAT-CBD3-H)。ST2-104低劑量組給藥劑量為3 mg/kg，ST2-104高劑量組給藥劑量為10 mg/kg，經(jīng)尾靜脈注射，連續(xù)給藥15 d。模型組及假手術(shù)組給予等量的生理鹽水。

1.3 AD模型的建立Wistar大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉(0.3 ml/100 g)，俯臥位固定于腦立體定位儀上。常規(guī)去毛、消毒后，在頭頂切開2-3 cm切口，分離骨膜。側(cè)腦室定位：以前囟點(diǎn)為原點(diǎn)，旁開1.8 mm，后開1.08 mm，深3.8 mm。用牙科鉆頭打孔，小心刺破腦膜，用微量移液器注射0.8 μl預(yù)先配備的凝聚態(tài)Aβ25-35，全部溶液在15 min內(nèi)注射完成。注射結(jié)束后，留針10 min。術(shù)后清理傷口，縫合皮膚。假手術(shù)組大鼠注射等量的生理鹽水。

1.4 認(rèn)知功能評價(jià)采用Morris水迷宮對給藥15 d后大鼠的認(rèn)知功能進(jìn)行評價(jià)。將水迷宮放置在黑暗隔音的房間中，水深20 cm，溫度控制在22℃，平臺(tái)置于第3象限，低于水面2 cm，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中平臺(tái)位置保持不變。給藥第9 d開始進(jìn)行定位航行訓(xùn)練，訓(xùn)練時(shí)間均為5 d，以4個(gè)不同象限為入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁放入水中，實(shí)時(shí)攝像監(jiān)測大鼠到達(dá)水下平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)，超過120 s 仍未找到則將大鼠引導(dǎo)至平臺(tái)，停留10 s 后移出。定位航行實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)束后，撤去平臺(tái)，進(jìn)行大鼠空間搜索檢測，觀察并記錄2 min內(nèi)大鼠穿越原平臺(tái)所在位置的次數(shù)和在原平臺(tái)停留時(shí)間，檢測大鼠空間定位能力，多次測量取平均值。

1.5 Western Blot檢測蛋白表達(dá)大鼠用烏拉坦麻醉，斷頭處死，冰上取出大鼠海馬組織，提取蛋白，BCA蛋白定量。蛋白上樣量為30 μg，先恒壓80 V，30 min，待樣品至分離膠時(shí)，調(diào)整電壓至120 V 持續(xù)90 min，蛋白分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，電流調(diào)至150 mA，用時(shí)2 h。加入5%脫脂奶粉，置搖床封閉2 h，加入按不同比例稀釋的一抗抗體CRMP2(1∶500)，pCRMP2(1∶1000)，NMDAR2B(1∶1000)，4 ℃過夜；1×TBST洗膜3 次，每次10 min；加入二抗(1∶2000)，室溫孵育2 h；1×TBST 洗膜3 次，每次10 min；ECL 底物液顯色。采用Quantity One 分析軟件計(jì)算條帶灰度值，目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值即為目的蛋白相對表達(dá)水平。

1.6 HE染色取大鼠海馬組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片。二甲苯Ⅰ脫蠟10 min，二甲苯Ⅱ脫蠟10 min，梯度乙醇脫水。蘇木精染色液10 min，沖洗，自來水反藍(lán)10 min，蒸餾水洗滌5 s，95%乙醇5 s，伊紅染色液10 s，梯度乙醇脫水，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明各5 min，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)的病理學(xué)形態(tài)變化。

1.7 免疫共沉淀檢測蛋白相互作用用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取大鼠海馬組織蛋白，取1 mg樣品蛋白，加入用于相應(yīng)免疫沉淀的一抗，陰性對照加入1 μg兔來源IgG，4℃緩慢搖動(dòng)過夜。再加入20 μl充分重懸的Protein A+G Agarose，4℃緩慢搖動(dòng)2 h。4℃12000 rpm/min離心1 min，輕輕棄去上清。PBS清洗2次，12000 rpm/min離心1 min，棄去上清。加入20 μl SDS-PAG緩沖液，渦旋重懸沉淀。沸水浴5 min，以游離抗原、抗體、Agarose，1000 g離心5 min，取上清，SDS-PAGE 凝膠電泳，進(jìn)行Western blot 檢測。

2 結(jié)果

2.1 TAT-CBD3多肽對阿爾茲海默病大鼠認(rèn)知能力的影響

Morris 水迷宮檢測結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡雜亂無章、無目的性，逃避潛伏期時(shí)間明顯延長，差異具有顯著性(P<0.001)；與模型組比較，TAT-CBD3組大鼠逃避潛伏期時(shí)間明顯縮短(P<0.05，P<0.01)。大鼠空間定位搜索檢測結(jié)果顯示，與假手術(shù)比較，模型組大鼠在2 min內(nèi)穿越原平臺(tái)象限時(shí)間(1.78±0.21 s)、跨越原平臺(tái)象限有效次數(shù)(3.21±0.45)均顯著降低(P<0.001，P<0.01)；與模型組比較，TAT-CBD3組大鼠在水池中定向軌跡運(yùn)動(dòng)更強(qiáng)，更加具有目的性，穿越原平臺(tái)時(shí)間和次數(shù)明顯增加(P<0.05，P<0.01)。水迷宮實(shí)驗(yàn)表明，TAT-CBD3多肽可以有效的改善大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，此作用在較低的濃度下即可發(fā)揮。

表1 TAT-CBD3對大鼠行為學(xué)的影響

2.2 TAT-CBD3多肽對阿爾茲海默病大鼠海馬神經(jīng)元的影響

大鼠海馬組織HE染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，細(xì)胞排列紊亂，結(jié)構(gòu)不清晰，出現(xiàn)壞死脫落，變形，核固縮碎裂現(xiàn)象。TAT-CBD3多肽治療后，細(xì)胞排列趨于整齊，正常神經(jīng)元數(shù)目明顯增多。表明TAT-CBD3多肽對AD損傷神經(jīng)元具有一定的保護(hù)作用。結(jié)果見圖1。

2.3 TAT-CBD3多肽對AD大鼠海馬組織NMDAR2B、CRMP2、pCRMP2蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，假手術(shù)組CRMP2蛋白表達(dá)量較多，pCRMP2蛋白磷酸化程度維持在較低水平；與假手術(shù)組比較，模型組AD大鼠腦組織pCRMP2蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.001)，相應(yīng)的總CRMP2蛋白表達(dá)降低；與模型組比較，TAT-CBD3高劑量組pCRMP2蛋白表達(dá)明顯減低(P<0.05)。另外，與假手術(shù)組比較，模型組NMDAR2B蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.001)；與模型組比較，TAT-CBD3高劑量組NMDAR2B蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。說明TAT-CBD3可以抑制AD大鼠海馬組織中NMDAR2B蛋白表達(dá)，并抑制CRMP2蛋白磷酸化。結(jié)果見圖2。

圖2 TAT-CBD3多肽對NMDAR2B、CRMP2、pCRMP2蛋白表達(dá)的影響

2.4 TAT-CBD3多肽對AD大鼠海馬組織中pCRMP2、NMDAR2B蛋白相互作用的影響

用常規(guī)IgG沉淀，沒有出現(xiàn)pCRMP2條帶，說明該免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)具有特異性；用NMDAR2B單克隆抗體沉淀pCRMP2/NMDAR2B復(fù)合體，顯示出pCRMP2條帶。與對照組比較，模型組沉淀的pCRMP2顯著增多(P<0.01)；與模型組比較，TAT-CBD3-H多肽組沉淀的pCRMP2顯著減少(P<0.01)。說明TAT-CBD3可以干擾pCRMP2與NMDAR2B蛋白的相互作用。結(jié)果見圖3。

圖3 TAT-CBD3對pCRMP2、NMDAR2B蛋白相互作用的影響

3 討論

當(dāng)前臨床上用于治療AD的藥物，療效并不十分理想[4]。小分子多肽尤其是從內(nèi)源性蛋白衍生的多肽因其與靶向蛋白具有同源結(jié)合位點(diǎn)，與靶蛋白親和力更高、靶向性更強(qiáng)，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[5]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，AD模型大鼠記憶力明顯減退，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列紊亂，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性受到破壞，TAT-CBD3多肽治療后大鼠記憶功能明顯改善，海馬神經(jīng)元損傷明顯減輕，表明TAT-CBD3多肽對于阿爾茨海默病具有治療作用。

AD的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，研究認(rèn)為，谷氨酸興奮性損傷是AD發(fā)生的重要機(jī)制之一。谷氨酸在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用非常廣泛，可以介導(dǎo)Mg2+、Ca2+等離子的內(nèi)流，參與神經(jīng)突觸的可塑性調(diào)節(jié)，與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)[6-7]。谷氨酸的作用是由谷氨酸受體介導(dǎo)的，NMDA受體有NMDAR1、NMDAR2等亞型，研究認(rèn)為NMDAR2B與AD關(guān)系更為密切。研究發(fā)現(xiàn)，NMDA受體過度激活可導(dǎo)致鈣內(nèi)流增加，引起鈣超載，進(jìn)而引發(fā)下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起神經(jīng)系統(tǒng)多種疾病，如阿爾茨海默病、帕金森病和癲癇等[8]。研究顯示，NMDARs拮抗劑在腦缺血再灌注損傷和腦外傷中具有神經(jīng)保護(hù)作用。目前，臨床上用于中、重度AD治療的美金剛即是非競爭性NMDARs拮抗劑[9]。由此可見，NMDARs的過度激活對AD的發(fā)病具有關(guān)鍵的作用，NMDARs可能成為AD治療的潛在靶點(diǎn)，抑制NMDAR的功能可能對于AD具有治療作用。本研究表明，AD大鼠海馬組織中NMDAR2B表達(dá)明顯增加，而TAT-CBD3多肽可明顯降低NMDAR2B蛋白表達(dá)，從而抑制其功能，減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載。

CRMP2是NMDARs的分子伴侶，兩者通過相互作用調(diào)節(jié)突觸前膜的鈣離子電流。CRMP2在AD的發(fā)病中起到重要作用[10]，研究發(fā)現(xiàn)，AD大鼠腦內(nèi)CRMP2磷酸化水平明顯增加。CRMP2是CRMPs蛋白家族的五種亞型之一，在海馬神經(jīng)元表達(dá)非常豐富。CRMP2即可介導(dǎo)生理效應(yīng)，又可引起病理反應(yīng)[11]。研究顯示，CRMP2通過CBD3與NMDAR結(jié)合，磷酸化的CRMP2與NMDAR結(jié)合后，可使后者活化，介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流增加。通過藥物干預(yù)或基因敲除CRMP2抑制CRMP2與NMDAR相互作用，可以抑制鈣離子內(nèi)流，起到細(xì)胞保護(hù)作用。本研究結(jié)果表明，給予TAT-CBD3多肽治療后，CRMP2磷酸化水平明顯降低，pCRMP2與NMDAR2B兩種蛋白之間的相互作用受到抑制[12-13]。

綜上所述，TAT-CBD3多肽對于阿爾茨海默病具有治療作用，抑制神經(jīng)元損傷，其機(jī)制可能與其降低腦組織中CRMP2蛋白磷酸化，抑制pCRMP2 與NMDAR 2B的相互作用，抑制細(xì)胞鈣超載有關(guān)。