嵇如月，趙晨蕊，方 玲

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 檢驗科，吉林 長春130033)

葉酸參與生物系統(tǒng)RNA和DNA的合成及氨基酸的代謝，懷孕期間由于細胞生長和增殖非常迅速，因而需要更多[1]。攝取量不夠或遺傳因素導致葉酸的利用能力降低，都能引起機體葉酸缺乏，亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)作為葉酸代謝通路中的一個關(guān)鍵酶，它包含11個外顯子及10個內(nèi)含子，位于1號染色體1p36.3上[2]。常見的突變?nèi)鏜THFR第4外顯子677位上胞嘧啶被胸腺嘧啶替代，從而使其編碼的纈氨酸被丙氨酸替代。MTHFR突變可造成葉酸代謝障礙，同型半胱氨酸水平升高，C677T位點的突變使酶對熱不耐受而使其活性降低，影響葉酸的代謝和利用。與CC型個體酶活性相比，CT型只有65%，而TT型僅有30%[3]。妊娠狀態(tài)的婦女該酶活性降低可導致葉酸代謝和利用障礙，增加流產(chǎn)發(fā)生的可能性，已有研究表明MTHFR基因多態(tài)性與原因不明復發(fā)性流產(chǎn)相關(guān)[4]。本研究調(diào)查了育齡女性MTHFR C677T基因多態(tài)性在長春地區(qū)的頻率分布情況，報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2019年2月到2020年5月在吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院門診進行葉酸利用能力遺傳檢測的900例育齡女性作為研究對象,年齡跨度從19歲到43歲,平均年齡29.4±4.1歲。其中進行孕前檢查的有360人，平均年齡29.3±4.1歲；妊娠狀態(tài)的有540人，平均年齡29.4±4.2歲。所收集對象均排除患有糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等基礎(chǔ)疾病及停經(jīng)原因待查等不確定是否為妊娠狀態(tài)的女性。

1.2 檢測方法

抽取每個待檢者2 ml EDTA 抗凝靜脈血，準備一對0.2 ml無菌的PCR薄壁管，分別在蓋子上標好M和WT，每份都需要做兩個反應，從4℃冰箱中把試劑拿出放置室溫后，迅速離心，把44 μl M擴增液加到M管中，再加入1 μl反應液；把44 μl WT擴增液加到WT管中，再加入1 μl反應液，蓋緊，漩渦樣混勻，快速離心以備使用。把5 μl待檢測的血樣本分別加入M、WT管中，蓋緊混勻，進行離心。把檢測卡取出，將M與WT管中的待檢測產(chǎn)物滴到樣品滴加處，3 min左右觀察檢測線上有沒有出現(xiàn)條帶，以此判斷結(jié)果即C677T位點的基因型。CC型結(jié)果顯示為M管在檢測線上不出現(xiàn)條帶，WT管在檢測線上出現(xiàn)條帶；TT型結(jié)果顯示為M管在檢測線上出現(xiàn)條帶，WT管在檢測線上不出現(xiàn)條帶；CT型結(jié)果顯示M管和WT管在檢測線上都出現(xiàn)條帶。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)均為計數(shù)資料，組間比較采用χ2檢驗方法，P<0.05表示為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 孕前檢查中不孕不育女性與對照組女性基因型頻數(shù)分布情況

在進行孕前檢查的360名女性中，165人被診斷為不孕不育(45.8%)，195人作為正常對照。經(jīng)χ2檢驗，CC、CT和TT基因型頻率在不孕不育組(8.5%、77.0%、14.5%)和對照組(7.7%、79.0%、13.3%)之間沒有顯著差異(P>0.05)。對等位基因C和T在兩組間的頻率進行χ2檢驗，發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T在該隊列中與不孕不育無關(guān)(P=0.96，OR [95%CI]=1.01[0.75-1.35])。見表1。

表1 孕前檢查女性MTHFR C677T基因型及等位基因分析

2.2 妊娠狀態(tài)中診斷為先兆流產(chǎn)女性與對照組女性基因型頻數(shù)分布情況

在妊娠狀態(tài)的540名女性中，80人被診斷為先兆流產(chǎn)(14.8%)，460人為正常對照。經(jīng)χ2檢驗，CC、CT和TT基因型頻率在先兆流產(chǎn)組(3.8%、78.8%、17.4%)和對照組(10.0%、83.5%、6.5%)之間具有顯著差異(P<0.05)。對等位基因C和T在兩組間的頻率進行χ2檢驗，發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T在該隊列中與妊娠先兆流產(chǎn)風險增加有關(guān)(P=0.04，OR[95%CI]=1.41[1.01-1.98])。見表2。

表2 妊娠狀態(tài)女性MTHFR C677T基因型及等位基因分析

3 討論

不孕不育是一個全球性熱點問題，近年來其患病率在不斷上升，其中約50%的病因源自女性不孕[5]，即使是備孕成功的女性，也存在著流產(chǎn)的風險。引起先兆流產(chǎn)的原因復雜多樣，某些先天性因素難以預防，因此臨床難以做出確切診斷[6]。MTHFR是參與葉酸的轉(zhuǎn)運和代謝的一種關(guān)鍵酶。目前，MTHFR 基因檢測被廣泛用于臨床診斷葉酸代謝能力，并為醫(yī)生在懷孕或懷孕期間使用葉酸等藥物提供了參考。本研究旨在調(diào)查MTHFR C677T基因型在長春地區(qū)孕前檢查和妊娠狀態(tài)的女性中的頻率分布情況，分析其是否與女性不孕不育及先兆流產(chǎn)相關(guān)。

研究顯示，尚未發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T 位點在該隊列中與不孕不育具有相關(guān)性，這與Soligo等人的報道相符[7]，該研究對巴西130名不孕癥婦女及260名育齡婦女進行分析，病例組突變頻率為58.5%(n=76)，對照組突變頻率為49.2%(n=128)，攜帶突變等位基因在兩組之間無顯著差異。其中，病例組中13名婦女(10%)和對照組中23名育齡婦女(8.8%)發(fā)生了純合子突變，經(jīng)分析后，純合子突變在兩組之間也無顯著差異。該研究結(jié)果表明，即使是純合MTHFR C677T突變，尚不能作為不孕癥的危險因素。但也有文獻表明C677T基因型與女性不孕不育存在相關(guān)性[8-9]。因此MTHFR C677T基因多態(tài)性對女性不孕不育的研究仍有爭議，這可能由于患者入選及排除標準不一致，且存在種族和地域的差異，人們長期的生活環(huán)境、飲食習慣也不盡相同，因此結(jié)果存在偏差。

在本隊列中，妊娠狀態(tài)女性先兆流產(chǎn)組與對照組比較，TT基因型頻率及T等位基因頻率均有顯著差異。因此推斷TT基因型突變可能是長春地區(qū)女性先兆流產(chǎn)的易感因素之一。楊瑞利等[10]對西安長安醫(yī)院452名孕婦進行研究，其中先兆流產(chǎn)組(n=132，CC 17.4%，CT 50.0%，TT 32.6%)和對照組(n=320，CC23.8%，CT 49.6%，TT 26.6%)基因型差異具有統(tǒng)計學意義,MTHFR C677T位點突變可能與女性先兆流產(chǎn)的發(fā)生有關(guān)。周青等[11]進行meta分析結(jié)果表明MTHFR C677T 基因多態(tài)性可能增加中國婦女先兆流產(chǎn)的風險(OR=1.13,95% CI 1.06-1.20)。以上研究均與本隊列結(jié)果一致。如果能在孕前盡早對備孕女性MTHFR C677T基因型進行檢測，并及時、合理地補充葉酸，可以降低先兆流產(chǎn)的發(fā)生。因此，MTHFR C677T檢測不僅為育齡婦女的葉酸補充提供了參考依據(jù)，對孕期不良狀態(tài)的預防也具有重要參考價值。鑒于本研究只針對長春地區(qū)女性，有一定局限性，今后有必要擴大隊列，對更大范圍地區(qū)的女性進行相應探究。在了解基因多態(tài)性等遺傳特征的基礎(chǔ)上，有針對性的制定出適合的衛(wèi)生政策，更好地幫助孕期及備孕女性合理補充葉酸。隨著分子生物學和基因工程的快速發(fā)展，臨床醫(yī)生和科研人員對于MTHFR C677T基因多態(tài)性的研究也將更為深入，這將為生殖疾病及其他相關(guān)疾病的診治及預防發(fā)揮重要作用。