武君華，王滿妮，王天菊，王小芳，尚利俠，陳 樂，房 婕，齊 珺

(西安市中心血站,陜西 西安710061)

人類對(duì)主要組織相容性復(fù)合物(MHC)的研究起源于同種異體組織器官移植和移植物的急性排斥反應(yīng)。人類的MHC稱為白細(xì)胞抗原(HLA)系統(tǒng)。HLA主要的遺傳特征是共顯性、多基因性和極度豐富的多態(tài)性。1958年第一個(gè)HLA抗原被檢出，經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展，相關(guān)工作者一直努力應(yīng)對(duì) HLA不斷擴(kuò)大的等位基因數(shù)量。截至2020年4月更新的國際免疫遺傳IMGT/HLA數(shù)據(jù)庫3.40.0版(http//:www.ebi.ac.uk/imgt/hla/stats.html)顯示，共計(jì)發(fā)現(xiàn)HLA-A座位等位基因6082種，B座位等位基因7255種，C座位等位基因5842種，DRB1座位等位基因2706種，DQB1座位等位基因1826種。本中心在2018-2019年對(duì)移植醫(yī)院造血干細(xì)胞供受者進(jìn)行HLA移植配型實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)2例供受者攜帶疑似新等位基因。經(jīng)確證實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后將序列上傳至世界基因庫(http:www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank Bankit)比對(duì)核準(zhǔn)，在向世界衛(wèi)生組織(WHO)提交一系列信息后，均被確認(rèn)為新等位基因，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

2018-2019年來西安市中心血站高分確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行造血干細(xì)胞移植(HSC)前HLA高分辨分型檢測過程中，分別發(fā)現(xiàn) 2例供受者攜帶疑似新等位基因。第1例先證者為患者，56歲，女性，臨床診斷為骨髓纖維化；第2例先證者為另一名患者的同胞哥哥，63歲，男性。在進(jìn)行HLA-A、B、C、DRB1、DQB1位點(diǎn)基因分型時(shí)，發(fā)現(xiàn)第1例先證者的HLA-DRB1位點(diǎn)、第2例先證者的HLA-DQB1位點(diǎn)分型結(jié)果異常，遂行進(jìn)一步確認(rèn)。

1.2 主要儀器

核酸自動(dòng)提取儀(臺(tái)灣Magcore HF16)；GeneQuant pro核酸檢測儀(美國GE公司 Biochrom)；PCR擴(kuò)增儀(德國SENSO公司 Sensoquest LabcycLer；美國MJ Research 公司 PCR-225;美國ABI公司 ABI9700)；流式微磁珠分析儀(美國Luminex公司 Luminex 200)；全自動(dòng)基因測序分析儀(美國ABI公司 ABI-3730xl)；ION S5TM測序儀(美國One Lambda公司)

1.3 主要試劑

1.4 方法

1.4.1標(biāo)本采集和基因組DNA提取 采集2例先證者外周靜脈抗凝血5 ml×2管。在發(fā)現(xiàn)2例先證者結(jié)果異常后，分別對(duì)先證者血樣重新采集抽提DNA并進(jìn)行確認(rèn)：一管血樣采用手工DNA提取試劑盒，按照試劑操作說明提取基因組DNA；另一管血樣用核酸自動(dòng)提取儀，嚴(yán)格按照儀器操作說明提取基因組DNA。

1.4.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-序列特異性寡核苷酸探針(PCR-SSO)方法檢測 PCR-SSO采用LABTypeTMRSSOH 1A/1B/1C/2B1/2Q試劑盒，嚴(yán)格按照說明書對(duì)2例樣本的HLA-A、B、C、DRB1、DQB1位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。即經(jīng)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與包被在微珠上的有熒光的特異性探針雜交結(jié)合后，通過Luminex IS-200流式微磁珠分析儀進(jìn)行讀板，應(yīng)用 Fusion4.1軟件進(jìn)行判讀。

1.4.4高通量測序(NGS)(ION S5TM測序平臺(tái)) 采用NXTypeTMNGS試劑盒，嚴(yán)格按照說明書分別對(duì)第1例樣本的I1-5’UTR全長序列和第2例樣本的3’UTR-5’UTR全長序列進(jìn)行特異性擴(kuò)增、定量、文庫構(gòu)建、乳化PCR產(chǎn)物等，最后上ION S5TM測序儀進(jìn)行測序，將所得序列用TypeStream VisualTMNGS Analysis Software軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

1.4.5單鏈測序方法 根據(jù)PCR-SBT結(jié)果，針對(duì)需要做的位點(diǎn)選擇相應(yīng)的單鏈擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增并測序，嚴(yán)格按照說明書分別對(duì)第1例樣本的HLA-DRB1*07位點(diǎn)、第2例樣本的HLA-DQB1*03和HLA-DQB1*04位點(diǎn)進(jìn)行單鏈測序反應(yīng)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)PCR-SSO/SBT分型結(jié)果第1例先證者PCR-SSO分型結(jié)果無異常探針反應(yīng)。PCR-SBT分型結(jié)果分別為HLA-A*02:01，30:01；B*13:02，15:02；C*06:02，08:01；B1*02:02,03:01；DRB1位點(diǎn)相對(duì)于DRB1*07:01,12:02序列在第2外顯子237位有1個(gè)堿基不匹配，由堿基G>R(A+G),二次復(fù)核無改變。結(jié)果見圖1。第2例先證者PCR-SSO分型結(jié)果無異常探針反應(yīng)。PCR-SBT分型結(jié)果分別為HLA-A*11:01，24:02;B*13:01，15:01；C*03:04，04:01；DRB1*04:05,04:06。DQB1位點(diǎn)相對(duì)于DQB1*03:02，04:01的基因序列，在第2外顯子256位有1個(gè)堿基不匹配，由堿基G>R(A+G)，經(jīng)兩次復(fù)核無改變。結(jié)果見圖2。

2.2 NGS及單鏈測序確證結(jié)果分別應(yīng)用NGS及單鏈測序方法對(duì)第1例先證者的HLA I1-5’UTR全長序列、DRB1*07單鏈進(jìn)行測序，兩種方法均證實(shí)DRB1*07序列在第2外顯子237位發(fā)生了G>A堿基突變，結(jié)果見圖3(NGS)、圖1。分別應(yīng)用NGS及單鏈測序方法對(duì)第2例先證者的HLA3’UTR-5’UTR全長序列、DQB1* 04單鏈進(jìn)行測序，兩種方法均證實(shí)DQB1*04序列在第2外顯子256位發(fā)生了G>A堿基突變，結(jié)果見圖4(NGS)、圖2。

圖1 第1例先證者DRB1位點(diǎn)測序結(jié)果

圖2 第2例先證者DQB1位點(diǎn)測序結(jié)果

圖3 第1例先證者NGS測序結(jié)果

圖4 第2例先證者NGS結(jié)果

2.3 家系調(diào)查分析根據(jù)基因測序分型結(jié)果，在征得本人知情同意后，對(duì)與第1例先證者有姐妹關(guān)系的兩位供者及其女兒進(jìn)行HLA-DRB1位點(diǎn)測序分析，結(jié)果顯示兩位姐妹的HLA-DRB1結(jié)果均為04:03,12:02；其女兒的HLA-DRB1結(jié)果為12:02,14:04，可以判定先證者的HLA-DRB1*12:02遺傳于父母，但由于無法獲取先證者父母血樣，所以HLA-DRB1*07的突變是直接來自于父母遺傳還是自身突變有待考證；其女兒的HLA-DRB1* 12:02遺傳自先證者，突變未遺傳給其女兒。先證者4位家庭成員的分型結(jié)果見圖5。第2例先證者因個(gè)人原因只有先證者及其同胞患者兄妹兩人進(jìn)行HLA分型實(shí)驗(yàn)，且其同胞患者分型結(jié)果與之全不相合，未能進(jìn)行家系遺傳情況分析。

注：黑色為先證者

2.4 新等位基因與同源性最高的等位基因序列比對(duì)及命名經(jīng)BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)第1例先證者的未知基因序列與其同源性最高的DRB1*07:01:01相比，第2外顯子第79位密碼子由GTG>GTA，編碼的氨基酸由纈氨酸Val(v)>纈氨酸Val(v),為同義突變。新基因與DRB1*07:01:01的核苷酸及氨基酸比對(duì)見圖6。第2例先證者的未知基因序列與同源性最高的等位基因DQB1* 04:01:01相比，未知基因第2外顯子第86位密碼子由GGG>AGG，編碼的氨基酸由甘氨酸Gly(G)>精氨酸Arg(R)，為非同義突變。新基因與DQB1*04:01:01的核苷酸及氨基酸比對(duì)見圖7。將2例先證者所檢測序列上傳至Genbank后分別獲得的Bankit ID(MN295058)和(MN295056)及相關(guān)數(shù)據(jù)提交給WHO HLA因子命名委員會(huì)，被正式命名為HLA-DRB1* 07:01:23(HWS10056299)和HLA-DQB1* 04:74(HWS10056295)。

圖6 HLA-DRB1*07：01:23與HLA-DRB1*07:01:01:01的核苷酸(部分)及氨基酸序列比對(duì)圖

圖7 HLA-DQB1*04：74與HLA-DQB1*04:01:01:01的核苷酸(部分)及氨基酸序列比對(duì)圖

3 討論

人類HLA基因位于人類第6號(hào)染色體的短臂(6p21.31)，DNA片段長度約為3 600 kb，占人基因組的1/3000。一般按HLA復(fù)合體在染色體上的排列分為HLA-Ⅰ類、HLA-Ⅱ類和HLA-Ⅲ類3個(gè)區(qū)。經(jīng)典的HLA基因位于HLA復(fù)合體的HLA-Ⅰ類區(qū)和HLA-Ⅱ類區(qū)內(nèi)，與移植排斥反應(yīng)和合成蛋白質(zhì)抗原功能有密切關(guān)系。為HLA-Ⅰ類分子α鏈編碼的Ⅰ類基因和為HLA-Ⅱ類分子的β鏈編碼的B基因是目前已知的多態(tài)性最為豐富的HLA基因。

隨著聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增技術(shù)和測序技術(shù)的應(yīng)用，HLA分型實(shí)驗(yàn)已經(jīng)由開始的血清學(xué)、細(xì)胞學(xué)階段提升到更為精確的分子生物學(xué)階段。目前，應(yīng)用于HLA檢測的主要技術(shù)有PCR-SSP、PCR-SSO、DNA測序、基因芯片等[1]。PCR-SSO技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、所需樣本量少等特點(diǎn)，適合大批樣本的 HLA分型初篩。但其無法直接反映基因序列，如果在陰性和陽性磁珠上的探針熒光強(qiáng)度處于臨界值，則可能出現(xiàn)結(jié)果誤判[2-5]?；跍y序的SBT檢測方法能夠直接從堿基水平得到HLA的等位基因序列，原始數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確率高達(dá)99%[6]，是目前HLA分型檢測公認(rèn)的金標(biāo)準(zhǔn)，具有高通量、高分辨率的特點(diǎn)[7-8]。但是由于HLA基因的多態(tài)性、等位基因的同源性和實(shí)際測序區(qū)域的限制性(兩個(gè)或多個(gè)等位基因在所檢測區(qū)域序列一致、該測定區(qū)域存在多種等位基因組合或者兩者差異在所檢測區(qū)域之外等)等，HLA每個(gè)位點(diǎn)等位基因的數(shù)量逐年增多，模棱兩可結(jié)果的比例也隨之增高。當(dāng)出現(xiàn)罕見等位基因或無完全匹配結(jié)果時(shí)，在排除實(shí)驗(yàn)原因后，可能提示疑似新等位基因，尤其出現(xiàn)不可修改的單峰變雙峰或雜合峰 A 變雜合峰 B情況時(shí)，應(yīng)高度懷疑新等位基因。此類結(jié)果的解決方案一般包括換用其他方法(如高分辨PCR-SSP方法進(jìn)行精確分型)、組特異性引物單鏈擴(kuò)增、特異性引物測序、增加外顯子測序范圍、NGS等[9]。NGS能夠在短時(shí)間內(nèi)同時(shí)對(duì)上百億堿基進(jìn)行測序[10]，等位基因漏失現(xiàn)象變的不太可能，也避免了PCR-SBT中的模棱兩可，使得罕見型和新等位基因的鑒定相對(duì)容易。其測序成本相對(duì)較低，耗時(shí)相對(duì)較短，在工作量大、時(shí)間緊迫時(shí)相對(duì)于傳統(tǒng)的一代測序分型有明顯優(yōu)勢[11]。然而 NGS 測序儀器及配套產(chǎn)品需要進(jìn)口，價(jià)格昂貴，各實(shí)驗(yàn)室需要結(jié)合自身的實(shí)際情況選擇適合的測序方法。隨著NGS成本的降低和準(zhǔn)確度的提高，其分型技術(shù)正逐漸成為基因診斷領(lǐng)域的主導(dǎo)技術(shù)[12]。

本文中2例先證者樣本在PCR-SSO檢測基因分型時(shí)探針反應(yīng)格局均正常，無異常探針反應(yīng)，提示該方法針對(duì)已知等位基因設(shè)計(jì)的探針存在漏檢新等位基因的風(fēng)險(xiǎn)。SBT是對(duì)DNA雙鏈的雙向測序，無法確定突變位于哪條DNA鏈上。為準(zhǔn)確區(qū)分突變位置，進(jìn)一步對(duì)第1例先證者的HLA-DRB1*07和第2例先證者的HLA-DQB1*03,-DQB1*04進(jìn)行組特異性單鏈測序，并應(yīng)用NGS進(jìn)行測序確證。最終分別確定了新等位基因HLA-DRB1*07:01:23和HLA-DQB1*04:74的堿基序列，而新等位基因來源于家系遺傳、個(gè)體突變或與疾病有關(guān)尚待研究。

目前國際上已檢出HLA-DRB1*07位點(diǎn)136種，其中3種被列入中國CWD表(2.4版)；已檢出HLA-DQB1*04位點(diǎn)110種，其中4種被列入中國CWD表(2.4版)。DRB1*07、DQB1*04與疾病的相關(guān)性研究已有諸多報(bào)道。在多項(xiàng)對(duì)慢性乙型病毒性肝炎、乙型肝炎病毒后肝硬化、肝癌等的研究中，JiangYG[13]等報(bào)道提示HLA-DRB1*07可能為機(jī)體感染乙型肝炎病毒后慢性化持續(xù)性感染過程的危險(xiǎn)因素；El-Chennawi等[14]研究發(fā)現(xiàn)，HLA-DRB1*07、DRB1*04為埃及肝癌發(fā)生的危險(xiǎn)因子,而DRB1*15為其保護(hù)性因子。Lin等[15]進(jìn)行的Meta分析證實(shí)DRB1*07、12是所有人群原發(fā)性肝癌的易感基因，而DRB1*15等位基因可能是亞洲人群肝癌的易感基因。另有研究提示，伊朗人中肺結(jié)核病與DRB1*07基因型密切相關(guān)[16]。一項(xiàng)對(duì)廣西壯族女性HPV16感染和宮頸癌易感性的關(guān)聯(lián)研究中發(fā)現(xiàn)HLA-DQB1*04等位基因是廣西壯族女性宮頸癌發(fā)生的易感基因，而HLA-DQB1* 06/09則相反，是其保護(hù)基因[17]。中國人Ⅰ型糖尿病(DM1)的易感性單倍型是DQB1*0401，DQB1*0405也可能與DM1發(fā)病相關(guān)[18];DQB1*0402是摩洛哥人DM1的易感基因，而在牙買加人中，DQB1*0402 則與DM1疾病的保護(hù)有關(guān)[19]。以上文獻(xiàn)均證實(shí)，HLA基因型與多種疾病的密切相關(guān)性，準(zhǔn)確的HLA分型是研究和臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)。

隨著NGS技術(shù)在HLA分型實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用，使得新等位基因被有效識(shí)別并快速鑒定，其被發(fā)現(xiàn)的數(shù)量也必將大幅提升。新等位基因的發(fā)現(xiàn)豐富了世界基因庫，增加了HLA系統(tǒng)多態(tài)性，為人類群體遺傳和進(jìn)化分析提供了寶貴的數(shù)據(jù)資料，并對(duì)臨床移植配型、法醫(yī)學(xué)親子鑒定、個(gè)體識(shí)別、輸血醫(yī)學(xué)及相關(guān)性疾病研究提供了基本數(shù)據(jù)，具有重要意義。