王 欣,曹軍麗,佟明銘

(1.秦皇島市中醫(yī)醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科,河北 秦皇島066000；2.秦皇島市第一醫(yī)院 腫瘤科)

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)對(duì)疾病診斷和預(yù)后評(píng)估有重要意義，被認(rèn)為是一種非侵入性的活檢替代指標(biāo)[1]。然而，外周血中的CTCs含量較少，檢測(cè)難度高，檢測(cè)前細(xì)胞富集是極為關(guān)鍵的一步。本研究通過對(duì)比Cell Search法和陰性富集聯(lián)合免疫熒光染色體原位雜交(NE-IFISH)技術(shù)對(duì)胰腺癌CTCs的檢測(cè)價(jià)值，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

秦皇島市第一醫(yī)院自2018年6月至2019年6月收治的41例胰腺癌患者，包括男性25例，女性16例，年齡41-80歲，平均(62.3±8.6)歲。所有患者均經(jīng)影像學(xué)檢查和穿刺活檢診斷為胰腺癌的初診病例，且未合并其他位置腫瘤。選擇同期體檢的40例健康志愿者為對(duì)照組，男性23例，女性17例，年齡42-78歲，平均(63.1±7.5)歲。兩組一般資料比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

1.2 CTCs富集方法

使用專用的CTCs采血管采集空腹肘靜脈血7.5 ml，室溫下離心，離心力800 g，離心時(shí)間8 min，棄去上清，下方沉淀轉(zhuǎn)移至離心管。采用移液器取3 ml CTCs分離液，加入離心管的底部，室溫離心，離心力450 g，離心時(shí)間8 min。離心后有3層液體，棄掉底層的棕紅色細(xì)胞，將上面兩層轉(zhuǎn)移至新的離心管，加入免疫磁珠，每管300 μl，室溫?fù)u床20 min。磁力架上混勻后，將液體再次轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的離心管，并加入CTCs富集緩沖液，顛倒混勻后，室溫離心，離心力550 g，離心時(shí)間4 min，棄掉上清，再次加入CTCs富集緩沖液，重復(fù)離心一次。得到的CTCs富集樣本分為兩份，一份用于Cell Search檢測(cè)，另一份用于NE-IFISH檢測(cè)。

1.3 CTCs檢測(cè)方法

Cell Search檢測(cè)：利用美國(guó)Biolegend公司提供的Cell Search系統(tǒng)測(cè)定標(biāo)本CTCs計(jì)數(shù)，CTCs判斷標(biāo)準(zhǔn)為EpCAM+、CK+、CD45-、DAPI+。NE-IFISH檢測(cè)：(1)棄上清，加2 μl染色液，震蕩搖勻后靜置20 min，加入抗體(組成為1 μl anti- CD45+1 μl anti- CEP-8+1 μl anti- CK18+1 μl Anti-h WBC+200 μl抗體溶劑)，避光孵育30 min。加入CTCs緩沖液，混勻后再次離心，550 g×4 min，棄上清，沉淀中加 CTCs固定液并涂片用于后續(xù)檢測(cè)。(2)根據(jù)說明書要求配置FR1/FR2混合液，滴加于載玻片，避光孵育10 min，吸除多余液體，以FR3液清洗4次。無水乙醇脫水后，避光條件下滴加10 μl探針，封片后置入雜交儀，76℃變性10 min；37℃雜交4 h，去除封片膠，溫浴脫除蓋玻片。采用抗體洗滌液洗滌4次。滴加5 μl DAPI染色液標(biāo)記細(xì)胞核，封片，顯微鏡下觀察CTCs。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 22.0分析數(shù)據(jù)，本研究中CTCs數(shù)目不符合正態(tài)分布，以中位數(shù)(最小值-最大值)表示，行Mann-Whitney檢驗(yàn)；CTCs陽性率采用百分比表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)；采用受試者工作曲線(ROC)分析CTCs的診斷價(jià)值；采用K-M法進(jìn)行生存分析；P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究組與對(duì)照組患者的CTCs檢測(cè)結(jié)果

在41例研究組患者中，NE-IFISH法共檢測(cè)到132個(gè)CTCs(33例患者陽性)，Cell Search法共檢測(cè)到111個(gè)CTCs(29例患者陽性)，NE-IFISH法檢測(cè)到的陽性率和CTCs總數(shù)略高于Cell Search法，但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但無論是NE-IFISH法還是Cell Search法，研究組的CTCs陽性率和CTCs數(shù)目均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表1。

表1 研究組與對(duì)照組患者的CTCs檢測(cè)結(jié)果匯總

2.2 兩種方法對(duì)胰腺癌的臨床診斷與病情評(píng)估價(jià)值

如表2所示，NE-IFISH法與Cell Search法對(duì)胰腺癌發(fā)生，胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及分期Ⅲ-Ⅳ期均有較好的評(píng)估價(jià)值(AUC=0.658-0.890，P<0.05)，在診斷胰腺癌發(fā)生和評(píng)估分期Ⅲ-Ⅳ期方面，NE-IFISH法的應(yīng)用價(jià)值優(yōu)于Cell Search法，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各個(gè)項(xiàng)目的ROC曲線詳見圖1。

表2 兩種檢測(cè)方法的臨床診斷與預(yù)后評(píng)估價(jià)值

圖1 兩種檢測(cè)方法診斷胰腺癌及其病理特征的ROC曲線

2.3 研究組患者手術(shù)前后的CTCs檢測(cè)結(jié)果

手術(shù)后，NE-IFISH法檢測(cè)到的陽性率和CTCs總數(shù)也略高于Cell Search法，但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；無論是NE-IFISH法還是Cell Search法，手術(shù)后的CTCs陽性率和CTCs數(shù)目均明顯低于手術(shù)前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 研究組患者手術(shù)前后CTCs檢測(cè)結(jié)果

2.4 兩種方法對(duì)胰腺癌的預(yù)后評(píng)估價(jià)值

本次研究共隨訪9-24個(gè)月，中位隨訪時(shí)間19個(gè)月，截止到末次隨訪，復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移27例，死亡11例，均死于復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。根據(jù)術(shù)后CTCs檢測(cè)情況，將患者分為CTCs陽性及CTCs陰性兩組，繪制生存曲線，結(jié)果顯示NE-IFISH法CTCs陽性和陰性患者的中位生存期分別為23個(gè)月和20個(gè)月，中位無進(jìn)展生存期分別為22個(gè)月和15個(gè)月；Cell Search法CTCs陽性和陰性患者的中位生存期分別為22個(gè)月和17個(gè)月，CTCs陽性患者生存期均低于CTCs陰性患者(P<0.05)。詳見圖2。

圖2 CTCs與胰腺癌術(shù)后生存的關(guān)系考察

3 討論

Cell Search系統(tǒng)是唯一被美國(guó)食品及藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)用于臨床檢測(cè)外周血CTCs的檢測(cè)平臺(tái)，但對(duì)胰腺癌CTCs的檢測(cè)精度不佳，主要是因?yàn)橐认侔樯掀らg質(zhì)轉(zhuǎn)化比較活躍的腫瘤，在這一病理行為中上皮細(xì)胞特異性抗原EpCAM表達(dá)會(huì)減弱[2]。NE-IFISH檢查通過CD45、CEP-8、CK18、DAPI 染色及雜交特異性來鑒別CTCs。CEP-8這一指標(biāo)主要反映8號(hào)染色體的異常，既往有研究對(duì)16種胰腺癌細(xì)胞系的分析結(jié)果顯示幾乎所有細(xì)胞的8號(hào)染色體均存在異倍性，故而CEP-8可以作為胰腺癌細(xì)胞的重要特征，在鑒別胰腺癌CTCs方面具有較高的優(yōu)勢(shì)[3-4]。

曹旻璐等[5]采用Cell Search系統(tǒng)檢測(cè)了7種腫瘤患者的CTCs情況，胰腺癌的術(shù)前和術(shù)后檢出率分別為62.0%和25.0%。本研究采用Cell Search系統(tǒng)檢測(cè)胰腺癌的術(shù)前和術(shù)后的CTCs檢出率分別為70.7%和37.2%，而NE-IFISH法的陽性率分別為80.5%和58.5%。另外，CTCs可以衡量腫瘤負(fù)擔(dān)，輔助病情診斷與預(yù)后評(píng)估的觀點(diǎn)已被較多學(xué)者所證實(shí)[5-7]，本研究還發(fā)現(xiàn)在診斷胰腺癌發(fā)生和評(píng)估分期Ⅲ-Ⅳ期方面，NE-IFISH法的應(yīng)用價(jià)值優(yōu)于Cell Search法。在隨訪中發(fā)現(xiàn)CTCs陽性患者的生存期和無進(jìn)展生存期均低于CTCs陰性患者。