周 迪，石張鎮(zhèn)，楊永凈，刁建東，白元松*，盧振霞*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 血液腫瘤科，吉林 長(zhǎng)春130033；2.吉林省腫瘤醫(yī)院 放療一科，吉林 長(zhǎng)春130012)

多藥耐藥(MDR)是急性髓系白血病(AML)患者化療失敗、腫瘤復(fù)發(fā)、生存期縮短的重要原因之一，對(duì)MDR機(jī)制的探索成為目前的研究熱點(diǎn)[1]。ATP結(jié)合盒(ABC)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族在其發(fā)生機(jī)制中的角色被逐漸認(rèn)識(shí)，乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)作為ABC家族重要成員之一，是一種依賴ATP酶的藥物排除泵，近年來被發(fā)現(xiàn)可能與包括米托蒽醌、柔紅霉素等在內(nèi)的多種抗腫瘤藥物的交叉耐藥有關(guān)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，AML患者中多藥耐藥基因(MDR1)和BCRP共表達(dá)與臨床耐藥、較低的完全緩解率、較差的總生存率相關(guān)[3]，BCRP可能是AML的耐藥機(jī)制之一。為了探討B(tài)CRP對(duì)AML患者耐藥性的相關(guān)性，本文對(duì)AML患者骨髓細(xì)胞的BCRP基因表達(dá)量、蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)不同濃度的DNR作用下AML骨髓細(xì)胞的藥物敏感性進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

吉林大學(xué)第三醫(yī)院收治的AML患者20例，其中男性8例，女性12例，年齡范圍為21-55歲。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的FAB診斷分型為M1 型1例、M2 型4例、M3 型6例、M4 型3例、M5 型6例。

具體分組：本研究中的20例AML患者中，結(jié)合患者的治療史，有12例為首次接受治療，為初治組，8例為既往接受治療并緩解后再次出現(xiàn)復(fù)發(fā)，為復(fù)發(fā)組。AML患者根據(jù)在院期間對(duì)治療的反應(yīng)，分為敏感組和耐藥組，其中有9例為敏感組，11例為耐藥組。具體分組情況見表1。

表1 AML患者具體分組情況

1.2 方法

1.2.1單個(gè)核細(xì)胞分離 所有患者均進(jìn)行骨髓穿刺術(shù)，吸取新鮮骨髓，稀釋2倍后，加入Ficoll淋巴細(xì)胞分離液，1 500 rpm離心30 min，分離出單個(gè)核細(xì)胞，計(jì)數(shù)備用。

1.2.2藥物干預(yù)及MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 根據(jù)柔紅霉素的血漿峰值濃度(PPC)，對(duì)96孔板中的單個(gè)核細(xì)胞給予不同濃度的柔紅霉素干預(yù)，包括2倍PPC、1倍PPC、0.5倍PPC、0.25倍PPC、0.125倍PPC，即40、20、10、5和2.5 μg/ml，各濃度分別設(shè)置4次重復(fù)。

在適宜條件下培養(yǎng)后，向細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入MTT溶液20 μl(濃度為5 mg/ml)，于4 h后取出96孔板，將液體吸出并棄去，立即加入150 μl二甲基亞砜，于37℃孵箱搖床震蕩10 min后終止。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔490 nm波長(zhǎng)處的吸光度(OD)。

PPC=20D(D為臨床化療計(jì)量單位mg·kg-1·d-1)；腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(1-試驗(yàn)孔OD值/對(duì)照孔OD值)×100%?；熕幬锔叨让舾校荷L(zhǎng)抑制率>50%；化療藥物中度敏感：生長(zhǎng)抑制率30%-50%；化療藥物低度敏感：生長(zhǎng)抑制率<30%。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)法檢測(cè)BRCP蛋白 單個(gè)核細(xì)胞(106個(gè))離心并應(yīng)用冷PBS洗滌后，應(yīng)用細(xì)胞固定液作用30-40 min，應(yīng)用冷PBS洗滌兩次，并向細(xì)胞中加入BCRP抗體，冰上避光靜置30 min。利用流式細(xì)胞分析檢測(cè)儀對(duì)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量記錄，每份樣本共計(jì)數(shù)104個(gè)細(xì)胞，以熒光染色陽性細(xì)胞百分率>10%作為陽性標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4RNA提取 取106數(shù)量級(jí)的單個(gè)核細(xì)胞，加入1 ml的RNA提取液TRIzol，震蕩并靜置，后加入異丙醇沉淀分離后，分別用70%和100%的冷乙醇洗滌及干燥，每份RNA樣本充分溶解于50 μl的去除RNA酶的三蒸水中，部分采取酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度并計(jì)算RNA濃度及含量；部分應(yīng)用瓊脂糖RNA電泳檢測(cè)樣本純度；部分用于后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。

1.2.5cDNA合成 通過RNA樣本濃度測(cè)定及計(jì)算，將2 μg的RNA樣本于提前冰浴的滅菌滅酶離心管中與oligo(dT)混合，使用dd水將RNA定容至13.5 μl，并在70℃金屬浴鍋中反應(yīng)5 min，迅速置于冰上靜置2 min，輕柔震蕩并離心，根據(jù)cDNA試劑盒說明書向反應(yīng)體系中加入Buffer、DTT、Rnasin及逆轉(zhuǎn)錄酶，并于42℃金屬浴鍋中反應(yīng)50 min，最后在95℃金屬浴鍋中反應(yīng)5 min。

1.2.6PCR反應(yīng)檢測(cè)BCRP基因表達(dá) 于離心管中分別加入cDNA樣本2 μl，前序及后序引物各1 μl，2×Master Mix 12.5 μl，應(yīng)用三蒸水定容至25 μl。將上述混合體系在94℃下反應(yīng)5 min。每個(gè)PCR循環(huán)包括94℃ 45 s、55℃ 45 s，72℃ 60 s，72℃ 7 min。在BCRP(32循環(huán))及β-actin(28循環(huán))PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，并應(yīng)用EB染色，應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)電泳產(chǎn)物進(jìn)行掃描、影像學(xué)分析、計(jì)算定量。以β-actin為內(nèi)參基因，檢測(cè)BCRP基因的相對(duì)表達(dá)量，與β-actin比例≥0.34即為BCRP陽性，PCR引物序列如表2。

表2 引物序列

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料兩兩比較時(shí)應(yīng)用t檢驗(yàn)，兩個(gè)及以上率或構(gòu)成比的比較應(yīng)用卡方檢驗(yàn)，P<0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BCRP基因表達(dá)與AML臨床表型的關(guān)系

2.1.1AML患者BCRP基因表達(dá)情況-質(zhì)控 對(duì)AML患者骨髓有核細(xì)胞的RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，EB染色后進(jìn)行凝膠成像，部分樣本組織的結(jié)果呈現(xiàn)如圖1所示?？梢娪镜纼?nèi)未見明顯的降解彌散區(qū)，無其他核酸物質(zhì)污染，提示樣本質(zhì)量完好無污染，可進(jìn)行后續(xù)BCRP基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算，并對(duì)BCRP基因表達(dá)是否陽性進(jìn)行鑒定。

BCRP：乳腺癌耐藥蛋白；M：marker；10：空白對(duì)照；1-9：AML患者骨髓有核細(xì)胞

2.1.2BCRP基因表達(dá)情況-mRNA表達(dá)量 20名AML患者骨髓中提取出的單個(gè)核細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)到BRCP的mRNA相對(duì)表達(dá)量，由低到高進(jìn)行梯度排序，可見BCRP基因在不同個(gè)體中的表達(dá)差異較大，具體結(jié)果見圖2。

BCRP：乳腺癌耐藥蛋白；1-20：AML標(biāo)本

2.1.3BCRP基因表達(dá)與AML臨床表型的關(guān)系-耐藥率 AML患者中，敏感組(n=9)BCRP陽性者為2例，治療耐藥組(n=11)中BCRP陽性5例，結(jié)果顯示治療耐藥組的BCRP陽性率較敏感組有增高趨勢(shì)但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(45.4% vs 22.2%,P=0.2785)。見表3。對(duì)本研究臨床資料及數(shù)據(jù)的分析顯示，BCRP在個(gè)體中表達(dá)量差異較大、mRNA的相對(duì)表達(dá)水平高低不同，但對(duì)RNA表達(dá)量的排序圖中發(fā)現(xiàn)可能的趨勢(shì)，即敏感組中BCRP表達(dá)較低，而耐藥組較高，提示BCRP可能與臨床耐藥有關(guān)，統(tǒng)計(jì)學(xué)沒有差異是與樣本例數(shù)較少有關(guān)。

表3 AML患者不同組BCRP陽性率

2.2 細(xì)胞存活率檢測(cè)

2.2.1不同濃度柔紅霉素對(duì)AML細(xì)胞存活率的影響 通過MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，并計(jì)算柔紅霉素對(duì)AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞的抑制率。結(jié)果顯示，柔紅霉素對(duì)AML患者的單個(gè)核細(xì)胞抑制率存在個(gè)體差異，但總體上藥物對(duì)細(xì)胞的抑制存在濃度依賴性，高濃度的藥物對(duì)細(xì)胞抑制率高于低濃度，其中2倍PPC柔紅霉素作用下抑制率為(33.87±16.36)%，0.125倍PPC柔紅霉素作用下抑制率為(16.36±18.37)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0029)。見圖3。

圖3 不同藥物濃度下的平均抑制率

2.2.2BCRP表達(dá)與細(xì)胞抑制率的比較 對(duì)BCRP表型不同的AML患者骨髓細(xì)胞的抑制率進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在0.125倍PPC柔紅霉素作用下，BCRP陰性組的細(xì)胞抑制率顯著高于BCRP陽性組的細(xì)胞抑制率[(24.09±18.68)% vs (1.99±0.80)%，P=0.001)]。在2倍PPC柔紅霉素作用下，BCRP陰性組的抑制率也顯著高于BCRP陽性組的抑制率[(39.26±15.25)% vs (20.58±3.67)%，P=0.002)]，如表4。上述結(jié)果提示，AML患者BCRP陽性表達(dá)，會(huì)使腫瘤具有對(duì)抗腫瘤藥物有耐藥的趨勢(shì)，且此趨勢(shì)與抗腫瘤藥物濃度無關(guān)。

表4 不同BCRP表達(dá)與細(xì)胞抑制率的比較

3 討論

急性髓系白血病是一種侵襲性克隆性疾病，是一種基因雜合性疾病，臨床治療中部分AML患者會(huì)因?yàn)槎嘀啬退幎鴮?dǎo)致腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)、預(yù)后不良。MDR是指惡性腫瘤細(xì)胞接觸一種抗癌藥后，對(duì)多種結(jié)構(gòu)不同、作用機(jī)制各異的其他抗癌藥產(chǎn)生耐藥性。MDR目前的具體病理生理學(xué)機(jī)制尚未被完全闡明，當(dāng)前被發(fā)現(xiàn)的可能機(jī)理包括多藥耐藥基因擴(kuò)增及其蛋白產(chǎn)物P-糖蛋白過表達(dá)(P-gp)，并且可能與B淋巴細(xì)胞瘤2(Bcl-2)通路、多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)以及肺耐藥相關(guān)蛋白(LRP)等諸多因素相關(guān)[4]。

Doyle等[5]在人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/Adrvp細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)了一段2.4kb mRNA，翻譯出具有665個(gè)氨基酸殘基的跨膜蛋白，并將其命名為BCRP。BCRP本質(zhì)上是半轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是ATP結(jié)合盒G2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABCG2)，其功能單位是同型二聚體或可能更大的寡聚體。近些年的研究發(fā)現(xiàn)BCRP在腫瘤細(xì)胞發(fā)生MDR中起到了重要作用，該基因的高表達(dá)與甲氨蝶呤、9-氨基喜樹堿、拓?fù)涮婵?、伊立替康和SN-38耐藥相關(guān)[6]，是一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素[7]。一項(xiàng)針對(duì)新診斷急性白血病患者的研究中顯示，BCRP基因陰性表達(dá)患者的完全緩解率明顯高于BCRP 基因陽性表達(dá)患者的完全緩解率(79.3% vs 31.6%)[8]。在一項(xiàng)針對(duì)AML患者膜排出通道的研究發(fā)現(xiàn)，352例初發(fā)AML中有64例白血病細(xì)胞具有特殊的膜排出通道，伴有BCRP高表達(dá)，提示BCRP所介導(dǎo)的ATP依賴性的藥物細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)增加是這類患者發(fā)生耐藥的可能機(jī)制[9]。

研究顯示33%的AML細(xì)胞會(huì)高表達(dá)BCRP，與患者的預(yù)后及總生存相關(guān)，然而BCRP表達(dá)與AML發(fā)生率相關(guān)性暫無報(bào)道[10]。在急性淋巴細(xì)胞白血病中，不同研究中對(duì)BCRP表達(dá)和藥物治療反應(yīng)相關(guān)性的結(jié)論不一致，可能與不同研究中BCRP檢測(cè)方法、樣本大小或患者是否有合并癥相關(guān)。目前認(rèn)為BCRP基因高表達(dá)是AML不良預(yù)后的預(yù)測(cè)因素，與白血病細(xì)胞的MDR密切相關(guān)[11]。

本研究納入了20例AML患者，根據(jù)治療是否敏感、對(duì)抗腫瘤藥物是否耐藥、是否復(fù)發(fā)等臨床表型對(duì)AML患者進(jìn)行分組，應(yīng)用RT-PCR及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨髓細(xì)胞中BCRP的基因及蛋白表達(dá)，應(yīng)用MTT檢測(cè)細(xì)胞抑制率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BCRP基因及蛋白的表達(dá)與耐藥有相關(guān)性，且BCRP陽性與AML患者細(xì)胞抑制率降低有關(guān)。

既往一項(xiàng)研究對(duì)不同亞型AML患者的BCRP基因表達(dá)水平進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)AML各亞型間BCRP基因表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[12]。本研究結(jié)果與前述結(jié)果一致，在不同AML分型中，M2型BCRP平均表達(dá)水平最低，M5 型BCRP平均表達(dá)水平最高，各個(gè)亞型之間BCRP基因表達(dá)無顯著差異，這也可能與該研究納入的病例數(shù)量較少相關(guān)。

綜上，本研究結(jié)果提示了BCRP高表達(dá)可能與AML耐藥及預(yù)后不良有關(guān)，盡管BCRP這種作用的具體信號(hào)途徑及機(jī)制尚有待探討，但BCRP通路抑制仍被認(rèn)為是提高藥效的藥理學(xué)策略。對(duì)BCRP的進(jìn)一步研究有助于揭示腫瘤耐藥的內(nèi)在機(jī)理，深入研究BCRP通路以及通過抑制BCRP通路減少藥物細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)、增加細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，值得不斷挖掘開發(fā)與探索。