阮 鵬，李 虹，李 勇，田 琪

(1.武漢中核中同藍博醫(yī)學檢驗實驗室有限公司，湖北 武漢430076；2.武漢市漢陽醫(yī)院 a.腫瘤科;b.檢驗科)

肝細胞癌(HCC)是臨床上最具侵襲性的惡性腫瘤之一[1]。據(jù)報道，一些長鏈非編碼RNA(LncRNA)可直接參與HCC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程，因其具有良好的細胞特異性和相對穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)[2]，有利于在體液中檢測到，可作為腫瘤診斷、預后和分類的潛在生物標志物。人類同源異型盒基因轉(zhuǎn)錄反義基因間RNA(HOTAIR)是第一個具有反式作用的LncRNA[3]。有研究顯示，LncRNA HOTAIR對于miR-122具有海綿吸附作用，能夠調(diào)節(jié)腫瘤細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[4]。miR-122屬于一類肝臟特異性 miRNA，是肝臟發(fā)育和病變的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[5]。但目前對于LncRNA HOTAIR/miR-122軸的了解仍處于基礎(chǔ)研究階段。因此本實驗擬檢測HCC患者循環(huán)血樣中外泌體LncRNA HOTAIR和miR-122表達情況與血清腫瘤標志物及肝外轉(zhuǎn)移的關(guān)系，從而為推動循環(huán)LncRNAs的臨床應用提供一定的臨床證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究經(jīng)本院研究倫理委員會批準，獲得所有受試者的書面知情同意后，采集血液樣本用于本課題研究，所有患者在取樣之前未接受過任何HCC相關(guān)治療。2019年1月—2020年1月在武漢市漢陽醫(yī)院共招募97例經(jīng)組織病理學檢查確診為HCC的患者，其中男57例，女40例，年齡40-82歲，平均年齡(60.53±11.62歲)，所有HCC患者均為初次確診，排除其他惡性腫瘤、肝轉(zhuǎn)移癌、血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、急慢性感染、嚴重腎功能不全者。同時選取50例非惡性病變患者的血清樣本作為良性對照，其中男31例，女19例，年齡40-73歲，平均年齡(58.76±12.87歲)； 匹配50名健康人血清為作為正常對照，其中男26例，女24例，年齡35-83歲，平均年齡(60.22±13.45歲)。取出血樣立即與乙二胺四乙酸混合，然后以3 000 r/min在4℃下離心15 min，收集上清液。將上清液儲存在-80℃以作進一步研究。比較HCC患者、良性對照組患者、正常對照組人群年齡、性別構(gòu)成、體質(zhì)指數(shù)無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1提取血清外泌體并鑒定 使用0.45 μm聚偏二氟乙烯(PVDF)過濾器(美國Millipore公司)，過濾血清樣本。ExoQuick溶液(美國System Biosciences公司)加入到血清樣本中混合均勻，-4℃放置30 min。然后用1 500 r/min超速離心法在4℃下離心30 min采集外泌體。采用磷酸鹽緩沖液(0.5 mg/ml)稀釋外泌體樣品，滴加到銅網(wǎng)上，用2%磷鎢酸溶液染色1 min，用2%的醋酸鈾酰在pH7.0下染色40 s，網(wǎng)格被測序并在室溫下風干。用透射電子顯微鏡(JEM-1-11顯微鏡)在100 kV電壓下對外泌體進行了檢測。Western blot法檢測外泌體標志蛋白CD9、CD63和TSG101相對表達量。

1.2.2實時熒光定量PCR(QPCR)法測定LncRNA HOTAIR與miR-122的相對表達量 使用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit(大連TAKARA生物公司)從外泌體樣本中提取總 RNA。測量Peqlab納米滴上的總RNA濃度，并在Agilent生物分析儀2100(深圳安捷倫科技有限公司)上使用RNA LabChips試劑盒檢測其質(zhì)量。用完整數(shù)>6.5的RNA進行cDNA合成，并用PrimeScriptTMRT reagent kit(大連TAKARA生物公司)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。用SYBR Premix Ex TaqTM II(大連TAKARA生物公司)進行實時PCR反應，在95℃下進行1個循環(huán)30 s反應，95℃下反應30 s和60℃下進行反應30 s共進行40個循環(huán)。

PCR中使用的引物序列如下：LncRNA HOTAI正向引物5’-CCT ACA AAG CCC TCT CTC CC-3’，反向引物5’-ATC ATA GCG GTC CTG GCT TG-3’； miR-122正向引物5’-TAG CAG AGC TGT GGA GTG TG-3’，反向引物5’-GCC TAG CAG TAG CTA TTT AGT GTG-3’。以GAPDH或者小分子U6作為內(nèi)源性對照。根據(jù)公式2-ΔΔCt計算目的基因相對表達量，試驗單獨重復三次。

1.2.3血清甲胎蛋白(AFP)、異常凝血酶原Ⅱ(PIVKA-Ⅱ)檢測 AFP和PIVKA-Ⅱ在同一份血清樣本中采用液相結(jié)合分析法在mTAS Wako i30型全自動分析儀(日本W(wǎng)ako Pure Chemical Industries公司)進行測定。AFP的測量范圍為0.3-2000 ng/mL，PIVKA-Ⅱ的測量范圍為5-100 000 mAU/mL。所有檢測均在武漢中核中同藍博醫(yī)學檢驗實驗室完成，在檢測前沒有任何技術(shù)人員被告知受試者的狀況。對2種生物標志物的陽性定義如下：AFP> 10 ng/mL，PIVKA-Ⅱ> 40 mAU/mL。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 外泌體的提取和鑒定

根據(jù)透射電鏡觀察和western blot法檢測，分離得到的囊狀小泡具有雙層膜結(jié)構(gòu)，呈圓形或橢圓形均勻分布，平均粒徑約110 nm(90-150 nm)，而且外泌體特異性標志物CD9、CD63和TSG101呈高表達，而外泌體陰性標志物Calnexin只在上清中表達(圖1)。

圖1 外泌體透射電鏡觀察、納米粒子跟蹤分析和western blot法檢測外泌體標志蛋白表達

2.2 3組外泌體中LncRA HOTAIR和miR-122相對表達量經(jīng)QPCR法檢測，與健康對照組和良性對照組比較，HCC組患者外泌體LncRNA HOTAIR相對表達量升高，同時miR-122相對表達量相應降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。經(jīng)Pearson法分析，HCC患者血清外泌體LncRNA HOTAIR和miR-122相對表達量呈負相關(guān)性，r=-0.740，P<0.001(圖2)。

表1 健康對照組、良性對照組、HCC組人群血清外泌體中LncRNA HOTAIR和miR-122相對表達量[M50(P25，P75)]

圖2 HCC患者血清外泌體LncRNA HOTAIR和miR-122相對表達量的線性關(guān)系

2.3 HCC組患者血清外泌體LncRNA HOTAIR和miR-122相對表達量與患者臨床病理特征的關(guān)系

HCC患者血清外泌體中LncRNA HOTAIR相對表達量與腫瘤直徑、N分期、T分期、M分期以及血清AFP、PIVKA-Ⅱ有關(guān)(P<0.05)，miR-122相對表達量則與腫瘤直徑、N分期、T分期、M分期、HBV或HCV感染以及血清AFP、PIVKA-Ⅱ有關(guān)(P<0.05)(表2)。

表2 肝細胞癌患者血清外泌體LncRNA HOTAIR和miR-122相對表達量與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.4 HCC組患者血清外泌體LncRNA HOTAIR和miR-122相對表達量與血清AFP、PIVKA-Ⅱ的關(guān)系

經(jīng)Pearson法分析，HCC患者血清外泌體LncRNA HOTAIR相對表達量與血清AFP、PIVKA-Ⅱ水平呈正相關(guān)性(r=0.669，0.620，P<0.001)(圖3A&3B)。而HCC患者血清外泌體miR-122相對表達量與血清AFP、PIVKA-Ⅱ水平則呈負相關(guān)性(r=-0.550，-0.521，P<0.001)(圖3C&3D)。

圖3 HCC組患者血清外泌體LncRNA HOTAIR和miR-122相對表達量與血清AFP、PIVKA-Ⅱ的相關(guān)性

2.5 血清外泌體LncRNA HOTAIR和miR-122相對表達量對HCC的診斷價值

經(jīng)ROC曲線分析，血清外泌體LncRNA HOTAIR和miR-122相對表達量診斷HCC的ROC曲線下面積略低于血清AFP和PIVKA-Ⅱ(P<0.05)，但是對于HCC肝外轉(zhuǎn)移的診斷效能則高于血清AFP和PIVKA-Ⅱ(P<0.05)(表3、表4)。

表3 血清外泌體LncRNA HOTAIR和miR-122相對表達量以及血清AFP、PIVKA-Ⅱ?qū)CC的診斷價值

表4 血清外泌體LncRNA HOTAIR和miR-122相對表達量以及血清AFP、PIVKA-Ⅱ?qū)CC肝外轉(zhuǎn)移的診斷價值

3 討論

外泌體是存在于細胞外微環(huán)境中的一類雙層膜囊狀小泡，直徑約為30-200 nm不等。幾乎所有生物的細胞都會分泌外泌體。外泌體的組成類似于親代細胞，并且能夠提供循環(huán)血中可追蹤的特定信號。外泌體被認為是正常和病理過程中眾多生物學過程中的關(guān)鍵因素。有證據(jù)表明，蛋白質(zhì)、DNA和各種形式的RNA，如miRNAs、LncRNA等，通過外泌體轉(zhuǎn)移，進而參與惡性腫瘤的發(fā)展[6]。盡管如此，外泌體的生理功能仍然很大程度上是未知的。

LncRNAs是一類具有生物學功能，但不能轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)的非編碼RNA。研究表明，人類基因組中約88%的單核苷酸多態(tài)性位于非編碼區(qū)，這表明許多非編碼 RNA和DNA的調(diào)控元件(如啟動子和增強子)在不同的細胞過程中都起著重要作用，例如細胞分化、細胞死亡和腫瘤發(fā)生等[7]。而且，與大多數(shù)蛋白質(zhì)編碼基因相比，LncRNAs具有更好的細胞特異性和相對穩(wěn)定的局部二級結(jié)構(gòu)，有利于在體液中的檢測，因而有望成為最具潛力的用于腫瘤診斷、預后和分類的生物標志物之一。本研究發(fā)現(xiàn)與健康對照組和良性對照組比較，HCC組患者血清外泌體LncRNA HOTAIR相對表達量逐漸升高，而且與患者的部分病理特征有關(guān)，例如腫瘤直徑、TNM分期和肝外轉(zhuǎn)移。HOTAIR是從12號染色體上的HOX基因組的反義鏈上轉(zhuǎn)錄而來的長2.2 kb的LncRNA。越來越多的證據(jù)表明HOTAIR的異常表達可參與多種類型癌癥細胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移、耐藥等過程。例如Yang[8]等學者發(fā)現(xiàn)，HOTAIR通過誘導MVB轉(zhuǎn)運到質(zhì)膜進而促進肝癌細胞分泌外泌體；而且還可以激活mTOR信號通路誘導Snap23的磷酸化，調(diào)節(jié)Rab35的表達和定位，進而促進肝癌細胞的增殖過程。此外，Zhao[9]等學者也發(fā)現(xiàn)，LncRNA HOTAIR在乳腺癌組織和細胞中的表達水平上升。敲除HOTAIR可抑制細胞增殖和轉(zhuǎn)移，促進細胞凋亡；而miR-20a-5p是HOTAIR的主要靶標之一，HOTAIR通過海綿吸附miR-20a-5p，進而緩解miR-20a-5p對下游HMGA2靶點的抑制作用，進而促進乳腺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移過程。上述數(shù)據(jù)均證實HOTAIR在多種腫瘤細胞中，包括肝細胞癌等發(fā)揮著促癌基因的作用。

除此以外，本研究還證實，HCC患者血清外泌體LncRNA HOTAIR相對表達量升高的同時，外泌體miR-122表達量則相應降低，且經(jīng)Pearson法分析，兩者表現(xiàn)出一定的負相關(guān)性。這可能與兩者存在一定的調(diào)控關(guān)系有關(guān)。Cheng[10]等學者通過細胞實驗發(fā)現(xiàn)，HOTAIR在HCC細胞中可以負調(diào)節(jié)miR-122的表達；抑制HOTAIR基因表達后可顯著抑制肝癌細胞的增殖和誘導細胞周期阻滯，同時也可上調(diào)miR-122基因的表達。從機制分析，可能是由于miR-122基因啟動子區(qū)存在CpG島，一方面HOTAIR可通過DNMTs介導的DNA甲基化抑制miR-122表達；另一方面HOTAIR也可通過EZH2上調(diào)DNMTs的表達。此外，HOTAIR可直接激活原癌基因 Cyclin G1表達進而加強對miR-122的抑制作用。因此HOTAIR介導的肝癌發(fā)生機制可能與抑制miR-122表達有關(guān)，進而為HCC臨床診斷和治療靶點的選擇提供了新的視角。本研究也證實檢測外泌體HOTAIR和miR-122相對表達量對于HCC的診斷有一定的臨床效能。雖然ROC曲線下面積和約登指數(shù)略低于血清腫瘤標志物AFP和PIVKA-Ⅱ，但是也可為提高診斷的特異性提供一定輔助性參考。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)血清外泌體HOTAIR和miR-122相對表達量與血清腫瘤標志物AFP和PIVKA-Ⅱ水平存在一定的線性關(guān)系。血清腫瘤標志物AFP和PIVKA-Ⅱ是目前臨床醫(yī)師常用的診斷HCC的參考指標，然而也存在一定的局限性，例如特異性較低、存在一定的滯后性等。許多研究中發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合檢測AFP和PIVKA-Ⅱ的敏感性在47.5%-94.0%之間，特異性在53.3%-98.5% 之間，但是這兩項指標對于HCC肝外轉(zhuǎn)移的診斷和預測價值較低[11]。本研究發(fā)現(xiàn)血清外泌體HOTAIR和miR-122相對表達量對于HCC肝外轉(zhuǎn)移診斷的臨床價值較高，甚至高于血清腫瘤標志物AFP和PIVKA-Ⅱ。這主要與LncRNA HOTAIR/miR-122對肝癌細胞轉(zhuǎn)移的調(diào)控機制有關(guān)。例如Zhou[12]等學者證實，HOTAIR通過負調(diào)節(jié)miR-646，進而顯著增強雌激素誘導的子宮內(nèi)膜癌細胞的遷移和侵襲作用。Chang[13]等學者也發(fā)現(xiàn)，HOTAIR抑制了卵巢癌細胞miR-206的表達，進而挽救性地上調(diào)CCND1和CCND2的表達，因此HOTAIR/miR-206/CCND軸也是HOTAIR促進腫瘤細胞的遷移和侵襲活性的途徑之一。同樣，Duan[14]等學者發(fā)現(xiàn)，mir-122能抑制卵巢癌細胞skov3和ovcar3的遷移和侵襲活性，其可能的作用機制與抑制腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達有關(guān)。而且最近Sang[15]等學者也通過臨床實驗得出一個結(jié)論，miR-122表達下調(diào)是肝癌切除術(shù)后無疾病進展生存的獨立危險因素之一。因此上述數(shù)據(jù)均表明針對HOTAIR/miR-122軸研發(fā)新的靶向治療藥物可能適用于肝外轉(zhuǎn)移的HCC患者或者用于抑制HCC患者發(fā)生肝外轉(zhuǎn)移。

綜上，HCC患者循環(huán)血外泌體中LncRNA HOTAIR表達上調(diào)，同時miR-122表達被抑制，并且兩者與HCC患者腫瘤直徑、TNM分期和肝外轉(zhuǎn)移有關(guān)，因此檢測LncRNA HOTAIR和miR-122相對表達量可以為HCC的早期診斷提供一定的參考，同時也可以判斷HCC患者肝外轉(zhuǎn)移，從而為尋找臨床診斷和治療新靶點提供新的思路。