崔念磊,薛 磊,蘇冬月,韓家凱,李丹丹

(1.濮陽惠民醫(yī)院 外二科,河南 濮陽457000；2.河南大學(xué)淮河醫(yī)院 內(nèi)分泌科,河南 開封475000)

胰腺導(dǎo)管腺癌是胰腺最常見的腫瘤，多發(fā)生于中老年人。腫瘤的形成與胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞異型增生有關(guān)。病變進(jìn)展過程中可見多種蛋白的表達(dá)失調(diào)[1]。真核翻譯起始因子5A2(EIF5A2)是一種能激活聚尿苷mRNA翻譯的哺乳動物蛋白，與上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)，是基因調(diào)控通路中的重要成員，對啟動下游基因誘導(dǎo)的增殖有重要價值[2]?；|(zhì)金屬蛋白酶-21(MMP-21)是MMPs家族中新發(fā)現(xiàn)的成員，對細(xì)胞外基質(zhì)的降解作用較強，可引起腫瘤細(xì)胞周圍的間質(zhì)重塑，使可溶性細(xì)胞因子分泌增多，加速腫瘤細(xì)胞的遷移。也有研究認(rèn)為MMP-21在細(xì)胞外基質(zhì)的活化和癌性間質(zhì)的形成中有重要作用[3]。本研究觀察胰腺導(dǎo)管腺癌中EIF5A2和MMP-21蛋白和mRNA的表達(dá)，分析其臨床價值。

1 資料與方法

1.1 臨床標(biāo)本及細(xì)胞株

選擇2013.01-2014.12期間在濮陽惠民醫(yī)院確診并行手術(shù)治療的79例胰腺導(dǎo)管腺癌患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合WHO中的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)；②臨床隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有其他器官惡性腫瘤；②Lynch綜合征；③術(shù)前行放、化療者；④患者或家屬不同意觀察者。年齡42-87歲，中位年齡58歲，其中男性41例，女性38例。留取腫瘤組織作為觀察組，留取距腫物邊緣大于3 cm的正常胰腺組織(經(jīng)病理證實)作為對照組，均留取新鮮組織(-80℃冰箱中凍存)和石蠟包埋組織。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者或家屬簽定知情同意書。選擇人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1，購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏細(xì)胞庫。

1.2 樣本量評估

按EIF5A2在預(yù)實驗中表達(dá)的陽性結(jié)果估計樣本量，采用兩樣本率比較的評估方法：即n1=n2=[(uα+uβ)/δ]2[π1(1-π1)+π2(1-π2)]，擬定對照組表達(dá)陽性率約10%，腫瘤中表達(dá)的陽性率約50%，差值40%，α取雙側(cè)0.05，計算n1=n2≈79例。

1.3 實驗方法

1.3.1免疫組化法 應(yīng)用免疫組化SP法檢測EIF5A2和MMP-21蛋白的表達(dá)。試劑均為濃縮液，購自武漢博士德生物技術(shù)公司。先行預(yù)實驗，選取顯色效果最理想的濃度(EIF5A2為1∶300、MMP-21為1∶250)進(jìn)行正式實驗，DAB顯色，嚴(yán)格按實驗步驟操作，均由同一檢驗師操作，設(shè)陽性和陰性對照。

結(jié)果判斷：陽性部位均是細(xì)胞質(zhì)，以二維角度進(jìn)行評價。以無、淺黃、黃、黃褐色分別計為0、1、2、3分。選擇5個顯微鏡(400倍)視野，以<5%為0分，5%-10%為1分，以11%-30%為2分，以31%-50%為3分，以>50%為4分。評分相加，總分為0-7分，以≤3分陰性，以>3分陽性。

1.3.2實時熒光定量PCR法(qPCR) 應(yīng)用實時熒光定量PCR法檢測EIF5A2和MMP-21 mRNA的表達(dá)。嚴(yán)格按實驗步驟進(jìn)行操作。引物見表1。應(yīng)用mRNA模板，該反應(yīng)體系的體積總計為30 μl。擴增程序： 95℃ 8 min，1個循環(huán)；95℃ 25 s，64℃ 20 s，72℃ 20 s，10個循環(huán)；93℃ 25 s，60℃ 35 s，72℃ 20 s，21個循環(huán)。于60℃時采集熒光信號，讀取Ct值。操作嚴(yán)格按實驗步驟完成，并設(shè)陽性對照和陰性對照，做好質(zhì)控工作。結(jié)果以S型曲線表示，以Ct值≤30為陽性，Ct值為Undet或>30為陰性。

表1 引物設(shè)計

1.3.3細(xì)胞培養(yǎng) 人胰腺癌細(xì)胞應(yīng)用10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。3天傳1代。在細(xì)胞對數(shù)生長期時收集細(xì)胞計數(shù)、進(jìn)行實驗。應(yīng)用Lip2000轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行操作。稀釋Lip2000、EIF5A2 siRNA和Control siRNA，將稀釋后的Lip2000與siRNA混勻，孵育20 min。取生長至對數(shù)期的細(xì)胞，以每孔5×105個接種于6孔板，細(xì)胞達(dá)50%生長融合度時，將Lip2000 siRNA形成的復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，混合后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。建立空白對照組、空載體組和EIF5A2 siRNA組，應(yīng)用Western Blot檢測MMP-21的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計分析

應(yīng)用SAS6.12軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，定量資料應(yīng)用 均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 表示，兩組間比較行配對資料的t檢驗或獨立樣本的t檢驗，率的比較行卡方檢驗，應(yīng)用Spearman相關(guān)分析和K-M生存分析，以P<0.05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果

2.1.1兩組中EIF5A2和MMP-21陽性率的比較 兩組中EIF5A2和MMP-21陽性率差別有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2、圖1。

圖1 EIF5A2和MMP-21的表達(dá)(IHC ×200)

表2 兩組中EIF5A2和MMP-21陽性率的比較(%)

2.1.2EIF5A2和MMP-21在不同臨床特征中表達(dá)的比較 EIF5A2和MMP-21的表達(dá)在不同增殖指數(shù)、脈管侵犯和K-ras基因突變的分組中差別有統(tǒng)計學(xué)意義。EIF5A2的表達(dá)在有無神經(jīng)侵犯的分組中差別有統(tǒng)計學(xué)意義。MMP-21的表達(dá)在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分組中差別有統(tǒng)計學(xué)意義。見表3、圖2、3。

表3 EIF5A2和MMP-21在不同臨床特征中表達(dá)的比較(%)

圖2 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(HE ×200)

圖3 Ki67的表達(dá)(IHC ×200)

2.1.3EIF5A2和MMP-21的相關(guān)性 應(yīng)用Spearman相關(guān)分析，顯示EIF5A2和MMP-21呈正相關(guān)性(r=0.69，P=0.037)。見圖4。

圖4 EIF5A2和MMP-21的相關(guān)性

2.1.4EIF5A2和MMP-21與生存時間的關(guān)系 患者均進(jìn)行術(shù)后5年生存時間的隨訪。截止時間為2019.12.31。其中存活10例，死亡64例，失訪5例。死亡患者術(shù)后生存時間為4-60個月。應(yīng)用K-M生存分析顯示EIF5A2(χ2=5.36，P=0.025)和MMP-21(χ2=5.97，P=0.011)的表達(dá)與生存時間相關(guān)，即EIF5A2和MMP-21高表達(dá)患者的預(yù)后差。見圖5。

圖5 EIF5A2和MMP-21與生存時間的關(guān)系

2.2 兩組中EIF5A2和MMP-21的mRNA表達(dá)的比較

兩組中EIF5A2和MMP-21的mRNA表達(dá)陽性率差別有統(tǒng)計學(xué)意義。見表4、圖6。

圖6 EIF5A2和MMP-21的mRNA表達(dá)(qPCR法)

表4 兩組中EIF5A2和MMP-21的mRNA表達(dá)的比較(%)

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)實驗中各組MMP-21的表達(dá)

相對于空白對照組和空載體組，EIF5A2 siRNA組中MMP-21的表達(dá)下降，提示EIF5A2 低表達(dá)可以引起MMP21的表達(dá)下調(diào)。見表5。

表5 細(xì)胞培養(yǎng)實驗中各組MMP-21的表達(dá)

3 討論

胰腺導(dǎo)管腺癌生長較快，由于部位的特殊性，發(fā)現(xiàn)較為困難，腫瘤體積常較大，邊界不清楚，并伴有明顯的出血和壞死。病理特征表現(xiàn)為明顯的異型腺管，間質(zhì)伴顯著的纖維化[4]。病變在形成和進(jìn)展中與腫瘤的生長和侵襲有關(guān)。研究認(rèn)為增殖、轉(zhuǎn)移和翻譯的相關(guān)蛋白均與病變的形成直接相關(guān)[5]。EIF5A2是在卵巢癌UACC-1598細(xì)胞中分離出來的基因，被TIF51B基因所編碼，在代謝和翻譯延長方面有重要作用。EIF5A2作為EIF家族中具有高度保守序列的基因，對腫瘤細(xì)胞生長和增殖、翻譯及mRNA轉(zhuǎn)化有一定作用。也有研究認(rèn)為EIF5A2與細(xì)胞凋亡相關(guān)[6]。陳杰偉等[7]通過觀察EIF5A2在食管癌中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)EIF5A2在腫瘤中高表達(dá)，認(rèn)為其參與了腫瘤的形成，并促進(jìn)腫瘤的侵襲過程。在腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移前，上皮和間質(zhì)可以出現(xiàn)轉(zhuǎn)化，即由分化和未分化二種狀態(tài)間的互相轉(zhuǎn)化，這使上皮細(xì)胞失去了上皮的特征，如黏附性和極性，并使腫瘤外圍的細(xì)胞獲得部分間質(zhì)細(xì)胞的特性，其功能和結(jié)構(gòu)也發(fā)生改變，并具有較高的侵襲能力和抗凋亡作用，使細(xì)胞骨架出現(xiàn)反轉(zhuǎn)性重構(gòu)，細(xì)胞具有較強的遷移特征。而EIF5A2在腫瘤進(jìn)展時具有這種轉(zhuǎn)化的促進(jìn)作用，并在部分腫瘤中已經(jīng)證實，如肝癌[8]、胃癌[9]等。在間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中，與間質(zhì)相關(guān)的因子可能伴有協(xié)同作用，如MMPs家族的相關(guān)成員。MMP-21是MMPs家族中的重要成員，編碼七個外顯子，廣泛表達(dá)于人類惡性腫瘤中，是重要的基質(zhì)水解酶，其對降解Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型膠原蛋白、層黏連蛋白的作用最強[10-11]。也有研究認(rèn)為MMP-21能使表皮生長因子的功能更完善，對細(xì)胞黏附的調(diào)節(jié)作用更強，腫瘤細(xì)胞具有更強的局部侵襲特征和遠(yuǎn)隔器官播散的作用[12]。

研究顯示胰腺導(dǎo)管腺癌中EIF5A2和MMP-21蛋白和mRNA的表達(dá)均明顯升高，提示EIF5A2和MMP-21的蛋白表達(dá)與mRNA的表達(dá)水平具有高度的一致性，提示二者是腫瘤形成的重要促進(jìn)蛋白。EIF5A2對mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯有重要的促進(jìn)功能，并能調(diào)控核質(zhì)運輸，對細(xì)胞質(zhì)的翻譯作用突出。EIF5A2是腫瘤細(xì)胞合成中蛋白合成的調(diào)控因子，可以引起細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的異型轉(zhuǎn)化，EIF5A2在發(fā)揮功能時也常受很多因素的影響，如缺氧、血管生成等[2]。EIF5A2還能通過多種機制誘導(dǎo)上皮和間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而對胰腺癌的形成和進(jìn)展起重要促進(jìn)作用。結(jié)果顯示EIF5A2和MMP-21的表達(dá)與增殖指數(shù)和脈管侵犯密切相關(guān)，提示EIF5A2和MMP-21高表達(dá)時可以引起腫瘤細(xì)胞繁殖加快，細(xì)胞生長旺盛，細(xì)胞數(shù)量增加，腫瘤體積增大，同時可以引起局灶脈管的侵襲，使腫瘤細(xì)胞進(jìn)入脈管，為轉(zhuǎn)移提供重要途徑。結(jié)果顯示EIF5A2和MMP-21的表達(dá)與有無K-ras基因突變相關(guān)，提示可能參與K-ras介導(dǎo)的機體細(xì)胞的異型增生，二者也可能與K-ras對抗的腫瘤治療相關(guān)。本研究顯示EIF5A2的表達(dá)與神經(jīng)侵犯密切相關(guān)，提示EIF5A2是嗜神經(jīng)生長的因子之一，EIF5A2也可能是神經(jīng)細(xì)胞的黏附相關(guān)蛋白，在對轉(zhuǎn)移性黏附的調(diào)節(jié)過程中起一定作用。結(jié)果顯示MMP-21與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示MMP-21高表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤的淋巴道播散，這與MMPs家族中相關(guān)成員的經(jīng)典功能較為一致，但是由于MMP-21降解的間質(zhì)成分較其他成員更多，因此MMP-21可能是家族中促進(jìn)轉(zhuǎn)移作用最強的。結(jié)果顯示EIF5A2和MMP-21的表達(dá)與生存時間相關(guān)，提示檢測二者的表達(dá)對預(yù)測患者的預(yù)后有一定價值。EIF5A2和MMP-21具有的正相關(guān)性，在胰腺癌細(xì)胞中觀察到EIF5A2 siNRA組中MMP-21表達(dá)下調(diào)，也驗證了二者具有可能的靶向調(diào)控關(guān)系。EIF5A2可能是上游基因，對MMP-21產(chǎn)生起一定的調(diào)控作用。EIF5A2在腫瘤中分泌增多，引起MMP-21高表達(dá)，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移[13]。此時包括MMP-21的MMPs家族中的多種成員的表達(dá)均升高，降解基底膜等腫瘤轉(zhuǎn)移的屏障，為腫瘤遷移提供了更直接的通路，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移的發(fā)生[14-15]。EIF5A2在病變進(jìn)展時使微管蛋白的組裝發(fā)生變化，使腫瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性發(fā)生改變[16]。此種作用的機制與EIF5A2激活聚尿苷mRNA的翻譯功能可能有關(guān)。也有觀點認(rèn)為MicroRNAs的相關(guān)因子與EIF5A2具有結(jié)合位點，通過靶向EIF5A2調(diào)控腫瘤的進(jìn)展[17]，其作用涉及腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及遷移等機制[18]。但是關(guān)于EIF5A2和MMP-21對腫瘤進(jìn)展的作用及調(diào)控通路有待更多基礎(chǔ)實驗來明確[19-20]。

總之，胰腺導(dǎo)管腺癌中EIF5A2和MMP-21蛋白和mRNA高表達(dá)，對病變的形成和進(jìn)展有明顯作用，二者可能具有協(xié)同正向作用，聯(lián)合檢測二者的表達(dá)對判斷預(yù)后可能有一定作用。