楊成超

(遼寧省楊樹研究所，遼寧 蓋州 115213)

楊樹Populusspp.屬于被子植物門Angiosperms雙子葉植物綱Dicots楊柳科Salicaceae楊屬，是多年生木本植物，無居間分生組織。它分布廣泛，易繁殖，是人工用材林、生態(tài)防護(hù)林及四旁綠化的重要樹種，具有重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價值。樹高是與楊樹木材產(chǎn)量密切相關(guān)的重要性狀之一。由于多年生楊樹樹體高大，樹高不易精確測定，故1年生苗的高生長研究在楊樹高生長形態(tài)建成研究中占據(jù)重要地位[1]。

高等植物通過調(diào)節(jié)頂端分生組織和側(cè)生分生組織的活性建立地上株型系統(tǒng)，分生組織的活性受環(huán)境信號、發(fā)育階段和遺傳因素的綜合調(diào)控，植物激素參與這些信號的整合。頂端優(yōu)勢是植物分枝調(diào)控的核心問題，而生長素對頂端優(yōu)勢的形成和維持發(fā)揮關(guān)鍵作用。Auxin/indole-3-acetic acid(Aux/IAA)蛋白是調(diào)節(jié)許多對生長素反應(yīng)現(xiàn)象的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，大部分Aux/IAA的功能已經(jīng)通過擬南芥獲得性突變體確定了。Aux/IAA和ARF轉(zhuǎn)錄因子是植物中生長素響應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，楊樹基因組中總計有35個Aux/IAA和39個ARF基因被識別[2]。Aux/IAA轉(zhuǎn)錄因子IAA9的功能涉及果實發(fā)育、葉片形態(tài)建成[3]和毛白楊P.tomentosa次生木質(zhì)部發(fā)育[4]。沈韻[5]研究了毛白楊的IAA9在木質(zhì)部、韌皮部、莖、根中的差異表達(dá)。目前未見到從歐洲黑楊P.nigra中克隆IAA9的報道。

為探討楊樹苗期高生長與內(nèi)源IAA的關(guān)系，從分子角度研究高生長形態(tài)建成，在黑楊派樹種高生長定位觀測[1]和內(nèi)源IAA及ABA含量分析[6]基礎(chǔ)上，本文以歐洲黑楊為材料，采用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技術(shù)克隆了與高生長密切相關(guān)、與葉片發(fā)育有關(guān)的生長素基因家族的PnIAA9，并進(jìn)行了楊樹Aux/IAA基因家族的進(jìn)化分析。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗材料

4月上旬，采用硬枝扦插技術(shù)，在花盆(直徑33 cm，高26 cm，底徑20 cm)內(nèi)扦插1段18 cm長歐洲黑楊1年生莖段?；ㄅ柚型寥罏樯橙劳僚c腐殖土混合物(體積比為3∶1)。溫室溫度控制范圍15～25 ℃，苗木常規(guī)水肥管理。7月中旬，剪取歐洲黑楊莖尖并置于凍存管中，立即投入液氮，取出后-80 ℃保存。

1.1.2 主要試劑

RNA 提取使用Trizol試劑(Invitrogen,USA)，ExTaq DNA Polymerase(TaKaRa，Japan)，RQ-DNase(Promega，USA)，RNase Inhibitor(TaKaRa，Japan)，MM-LV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega，USA)，dNTP(華綠源生物，中國)，pGEM-T easy試劑盒(Promega，USA)，PCR擴增產(chǎn)物回收和純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒(AxyGen，USA)，SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech，USA)，引物合成(北京奧科生物，中國)。

1.2 試驗方法

1.2.1 Total RNA提取及檢測

按照Trizol試劑盒說明書提取歐洲黑楊總 RNA，使用Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent RNA 6000 Nano Kit)檢測總 RNA的濃度、RIN值、28S/18S和片斷大小。樣本的純度使用紫外分光光度計NanoDropTM進(jìn)行測定。

1.2.2 基因的克隆

RACE引物設(shè)計：根據(jù)PopulusDB EST數(shù)據(jù)庫中IAA9序列設(shè)計RACE引物如下：3IAA9：5′-CCCTTTGCATCCCTCAAATGATGGTC-3′；5IAA9：5′-GCGGAGCTGTTACGAAGTGGTCTGGT-3′。其中，3IAA9從基因的3′ 端克?。?IAA9從基因的5′ 端克隆。

歐洲黑楊I(lǐng)AA9基因的克隆采用SMART RACE技術(shù)，詳細(xì)過程參照Clontech生物公司生產(chǎn)的SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit說明書。

反轉(zhuǎn)錄：分別向標(biāo)記5′和3′ 的200 μL PCR反應(yīng)管內(nèi)加2 μL RNA；向標(biāo)記3′ 的PCR反應(yīng)管內(nèi)加1 μL 3′RACE CDS，1 μL Extension Buffer，1 μL H2O混勻后72 ℃溫浴2 min，立即冰浴冷卻；向標(biāo)記5′ PCR反應(yīng)管內(nèi)加1 μL 5′ RACE CDS，1 μL Extension Buffer，1 μL 5′ RACE SMART Oligo混勻后72 ℃溫浴2 min，立即冰浴冷卻；分別向上述PCR反應(yīng)管內(nèi)加1μL DTT，2μL 5×First strand buffer，1 μL dNTP和1 μL SuperScriptase II，混勻后42 ℃溫浴60 min，48 ℃溫浴30 min。反轉(zhuǎn)錄完畢，分別向各反應(yīng)管內(nèi)加100 μL滅菌水，混勻后-20 ℃保存。

3′ RACE/5′ RACE擴增：分別向標(biāo)記5′和3′兩個200 μL PCR反應(yīng)管內(nèi)加2.5μL相應(yīng)的第一鏈合成產(chǎn)物；向5′ 標(biāo)記的PCR反應(yīng)管內(nèi)分別加1μL ycc5IAA92(10 μmol·L-1)引物，向3′ 標(biāo)記的PCR反應(yīng)管內(nèi)分別加1 μL ycc3IAA92(10 μmol·L-1)引物；向上述PCR反應(yīng)管內(nèi)分別加47.5 μL按照說明書配制的反應(yīng)混合液，混勻后立即按照下列反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng)：先96 ℃預(yù)變性1 min，然后 96 ℃ 10 s、72 ℃ 2 min進(jìn)行10個循環(huán)，再96 ℃ 10 s、68 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min 15個循環(huán)。反應(yīng)完畢后，取5 μL在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增片段的特異性和大小。

擴增產(chǎn)物切膠純化：使用AxyGen公司生產(chǎn)的瓊脂糖凝膠及PCR產(chǎn)物純化試劑盒，對PCR擴增產(chǎn)物切膠純化。

T-載體連接、轉(zhuǎn)化和測序：將凝膠純化的目的片段按照操作說明與pGEM-T Easy載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞。在含有IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)和X-gal(β-半乳糖苷酶)的LB/Amp平板篩選陽性植株，提出質(zhì)粒并測序。測序引物是M13F和M13R，測序結(jié)果拼接后得基因的全長序列。

1.2.3 基因IAA9序列分析及進(jìn)化樹構(gòu)建

應(yīng)用DNAMAN軟件對克隆的PnIAA9進(jìn)行序列分析，應(yīng)用美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)Conserved Domains分析PnIAA9結(jié)構(gòu)域，應(yīng)用Culusterx軟件進(jìn)行氨基酸多序列比對。在文獻(xiàn)分析基礎(chǔ)上，從NCBI找到楊樹中Aux/IAA家族基因并下載序列，應(yīng)用MEGA7軟件，通過NJ(Neighbor-joining)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 歐洲黑楊I(lǐng)AA9基因克隆

提取的歐洲黑楊莖尖的總RNA質(zhì)量參數(shù)為OD260∶OD280=1.98，OD230∶OD260=2.01。總RNA 28S/18S條帶亮度比值大于2，表明提取的總RNA經(jīng)RNase-free DNase處理后完整性較好，沒有降解和雜質(zhì)污染現(xiàn)象。

圖1為IAA9基因的5′ RACE和3′ RACE擴增圖譜，從圖1可以看出，IAA9 5′ RACE 克隆特異性比較好，為單一條帶擴增的產(chǎn)物，大小為900 bp左右。而3′ RACE克隆特異性比較差，被擴增的產(chǎn)物大小為700 bp左右的特異條帶，此外在1.0 Kb有一條非特異擴增條帶。通過切膠回收5′ RACE產(chǎn)物和3′ RACE產(chǎn)物700 bp左右的條帶，連接T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)測序分析，獲得IAA9基因5′ 和3′ RACE序列。去掉重復(fù)序列，經(jīng)拼接得到IAA9全長，命名為PnIAA9，長度為1 786 bp。全長DNA序列和氨基酸序列見圖2。

注：M為DL2000 Plus Marker；1為3′ RACE；2為5′ RACE。

圖2 PnIAA9全長DNA序列和氨基酸序列

把PnIAA9 full length數(shù)據(jù)在NCBI中做Blast，得到的100個結(jié)果中，前14個結(jié)果的Per.Ident大于90%，其中第一位的P.deltoides值達(dá)到99.73%；排第2位的auxin-responsive proteinIAA9[P.trichocarpa]Per.Ident達(dá)到99.18%；排前11位的都是楊樹的IAA9。

2.2 PnIAA9序列分析

利用DNAMAN軟件進(jìn)行分析，該基因編碼一條由365個氨基酸組成的多肽鏈(圖3)。

圖3 PnIAA9全長序列的開放閱讀框

PnIAA9結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，其屬于Aux/IAA家族。氨基酸序列特異點區(qū)間212～357，E-value= 6.19e-110，E-value數(shù)值小說明結(jié)果很有意義。Aux/IAA基因的轉(zhuǎn)錄是由植物激素生長素快速誘導(dǎo)的，該家族的一些成員較長，并包含一個N末端DNA結(jié)合域。

選擇PnIAA9和從NCBI下載的毛果楊I(lǐng)AA9、IAA20、IAA32、IAA33氨基酸序列，進(jìn)行氨基酸多序列比對，結(jié)果見圖4。典型的Aux/IAA蛋白具有4個保守結(jié)構(gòu)域，分別稱為Domain I、II、III和IV[7]。Domain I、II位于氨基端(N端)，而Domain III和IV位于羧基端(C端)。Domain II是Aux/IAA蛋白被泛素化降解的靶位點，其核心序列VGWPP是經(jīng)典蛋白降解序列。PnIAA9、IAA9和IAA20都具有VGWPP序列(圖4中黑色方框)，說明PnIAA9等3個蛋白易受到生長素的降解，是短命蛋白。

圖4 PnIAA9等氨基酸多序列比對結(jié)果

2.3 PnIAA9 與楊樹Aux/IAA進(jìn)化樹構(gòu)建

綜合文獻(xiàn)分析結(jié)果，在NCBI上找到并下載18個楊樹Aux/IAA生長素響應(yīng)蛋白序列，多數(shù)屬于毛果楊P.trichocarpa基因組，與從歐洲黑楊中克隆的PnIAA9構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，PnIAA9與毛果楊的IAA9同源性最高，與毛果楊的IAA33基因序列相似度最低，進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖5 PnIAA9與18個楊樹Aux/IAA進(jìn)化樹構(gòu)建

3 結(jié)論與討論

楊樹苗高由節(jié)間長和節(jié)間數(shù)構(gòu)成，由于其葉互生，節(jié)間數(shù)量與葉片的數(shù)量密切相關(guān)。在枝條長度相等時，美洲黑楊節(jié)間相對較長但節(jié)間數(shù)量少，歐洲黑楊節(jié)間相對較短但數(shù)量較多。通過克隆歐洲黑楊節(jié)間數(shù)量基因，再通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)化到美洲黑楊，可能培育出節(jié)間長且節(jié)間數(shù)量多的速生樹種。

一般認(rèn)為，IAA和葉的起始有關(guān)[8]，阻斷生長素的運輸會阻止葉的起始，在擬南芥的生長素運輸缺陷突變體中可以觀察到這個現(xiàn)象[9]。高紅兵等[10]應(yīng)用GC-MS-SIM技術(shù)測定了毛白楊休眠芽中IAA和ABA含量，楊成超等[6]研究了IAA與ABA含量的比值與3個黑楊派楊樹苗高的關(guān)系，結(jié)果表明苗高月增量與頂芽的IAA/ABA呈顯著正相關(guān)。目前，在擬南芥中已經(jīng)有通過Aux/IAA9調(diào)控來調(diào)節(jié)擬南芥生長的研究[11]。

本研究從歐洲黑楊莖尖中克隆的PnIAA9基因長度為1 786 bp，編碼365個氨基酸，并進(jìn)行楊樹Aux/IAA家族的進(jìn)化分析。將來可以利用基因編輯等技術(shù)提高或降低頂端分生組織IAA的含量來調(diào)控內(nèi)源IAA/ABA含量的比值，也可以通過對IAA的調(diào)控來控制節(jié)間數(shù)量的多少實現(xiàn)苗高性狀的分子調(diào)控和遺傳改良，從而為培育矮化園藝植物和超級速生楊樹打下基礎(chǔ)。