黃 婷 彭冠明 林昌明 司徒榮貴 毛積鵬,2

（1. 臺(tái)山市紅嶺種子園，廣東 臺(tái)山529223；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院/廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642）

猴耳環(huán)Pithecellobium clypearia為豆科Leguminosae 猴耳環(huán)屬植物，廣泛分布于我國(guó)南方各省，是一種重要的藥用植物，具有抗炎、抗菌和抗病毒等多種功效[1-7]。猴耳環(huán)中化學(xué)成分種類繁多，主要有黃酮類、氨基酸類、生物堿類、糖及酚類等[8-9]。其中沒食子酸、槲皮素和表沒食子兒茶素沒食子酸酯等黃酮類化合物為猴耳環(huán)代表性藥用特征標(biāo)志物[10-12]。猴耳環(huán)的入藥部位主要以干燥的幼枝和葉片組織為主，但也有直接以莖干切片入藥。前期相關(guān)學(xué)者利用高效液相色譜法和核磁共振波普等方法于猴耳環(huán)的主要藥用部位嫩枝和葉中成功鑒定出沒食子酸、槲皮素、槲皮苷、兒茶素和表沒食子兒茶素等多種高生物活性的黃酮類化合物[13-14]。傳統(tǒng)藥用植物活性成分的鑒定具有單一性、分析通量有限，難以系統(tǒng)闡明藥用植物的有效成分及其植株體內(nèi)的分布情況。而超高效液相色譜法—串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLC-MS/MS）作為目前代謝組學(xué)分析中的常用手段具有高靈敏、高通量、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，能高效快速地掌握植物內(nèi)源性代謝物成分及其動(dòng)態(tài)變化信息[15]。本研究利用UPLC-MS/MS 代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)猴耳環(huán)的主要藥用部位嫩枝和葉組織部位中的主要代謝物成分進(jìn)行了測(cè)定，旨在為猴耳環(huán)代謝物成分鑒定及其分布特性提供重要信息，為猴耳環(huán)的質(zhì)量控制和合理開發(fā)利用提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

猴耳環(huán)樣本材料來(lái)自于廣東省臺(tái)山市紅嶺種子園。于2019 年9 月份取樣，采取了2 a 生且生長(zhǎng)旺盛的猴耳環(huán)嫩枝（NZ）和葉片（LY）組織部位，每個(gè)組織部位3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，適當(dāng)剪碎后放入50 mL 無(wú)菌的離心管中隨即放入液氮中，最后-80 ℃保存。

1.2 樣本制備

將猴耳環(huán)各組織部位樣本于凍干機(jī)（Scientz-100F）中真空冷凍干燥，干燥后利用研磨儀（MM 400，Retsch）研磨至粉末狀。稱取約100 mg 粉末溶解于1.2 mL 70%甲醇（色譜級(jí)，Merck）4 ℃ 條件下提取12 h，每2 h 渦旋震蕩1次，以提高提取率。12 000 rpm 離心10 min 取上清液，用0.22 μm 微孔濾膜過濾樣本，隨后保存于進(jìn)樣品中用于UPLC-MS/MS 分析。

1.3 色譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集

分別利用超高效液相色譜（SHIMADZU Nexera X2）和串聯(lián)質(zhì)譜（Applied Biosystem 4500 QTRAP）儀器系統(tǒng)采集猴耳環(huán)嫩枝和葉組織的色譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)。色譜數(shù)據(jù)收集參數(shù)設(shè)置如下：色譜柱：Agilent SB-C18, 1.8 μm, 2.1 mm×100 mm；流動(dòng)相：A 相為超純水（加入0.1%的甲酸），B相為乙腈（色譜級(jí)，Merck）；洗脫梯度：0.00 min，B 相比例為5%，9.00 min 內(nèi)B 相比例線性增加到95%，并維持 1 min；10.00～11.10 min，B相比例降為5%，并以5%平衡至14 min；流速設(shè)置為0.35 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量4 μL。

質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集條件為：電噴霧離子源（Electrospray Ionization，ESI） 溫 度550 ℃， 質(zhì) 譜 電壓5 500 V（正模式）/-4 500 V（負(fù)模式），簾氣（Curtain gas，CUR）25 psi，碰撞誘導(dǎo)電離（Collision-Activated Dissociation, CAD）參數(shù)設(shè)置為高。在三重四級(jí)桿中每個(gè)離子對(duì)是根據(jù)優(yōu)化的簇電壓（Declustering Potential，DP）和碰撞能進(jìn)行掃描檢測(cè)[16]。

1.4 代謝物定性與定量分析

基于邁維代謝公司的自建數(shù)據(jù)庫(kù)MWDB（metware database），根據(jù)二級(jí)譜信息進(jìn)行物質(zhì)定性分析，分析時(shí)去除同位素信號(hào)、含K+離子、Na+離子和NH4+離的子重復(fù)信號(hào)。代謝物定量則是利用三重四級(jí)桿質(zhì)譜的多反應(yīng)檢測(cè)模式進(jìn)行。四級(jí)桿首先篩選目標(biāo)物質(zhì)的前體離子，前體離子經(jīng)誘導(dǎo)電離后形成碎片離子，碎片離子通過三重四級(jí)桿過濾選擇出特征碎片離子。隨后進(jìn)行峰面積積分，并對(duì)其中同一代謝物在不同樣本中的質(zhì)譜出峰進(jìn)行積分校正[17]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用MultiaQuant 軟件和Analyst 1.6.3 軟件處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并進(jìn)行色譜峰的積分和校正工作，每個(gè)色譜峰的面積代表對(duì)應(yīng)物質(zhì)的相對(duì)含量，最后導(dǎo)出所有色譜峰面積積分?jǐn)?shù)據(jù)保存。隨后對(duì)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（Orthogonal Partial Least Squares—Discriminant Analysis，OPLS-DA），通過載荷圖和變量重要性投影（Variable Importance in Projection，VIP）值大于等于1 來(lái)篩選差異代謝物。PCA 用R 軟件中的Prcomp 函數(shù)對(duì)進(jìn)行歸一化處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。OPLS-DA 在原始數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2 轉(zhuǎn)換后，進(jìn)行中心化處理，利用R 軟件中的MetaboAnalystR 包的OPLSR.Anal 函數(shù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝物鑒定

利用UPLC-MS/MS 法在猴耳環(huán)的嫩枝和葉組織中共鑒定出712 種代謝物成分，其正離子模式下混合樣本的質(zhì)譜分析總離子流圖如圖1 所示，各峰分離效果良好表明儀器精密度良好結(jié)果可靠。其中氨基酸類物質(zhì)78 種，酚酸類物質(zhì)127 種，核苷酸及其衍生物44 種，類黃酮化合物148 種，生物堿類22 種，木脂素和香豆素類化合物15 種，有機(jī)酸類70 種，脂質(zhì)類129 種，維生素類11 種，鞣質(zhì)類9 種，萜類化合物9 種，糖及醇類40 種，其它類化合物10 種。148 種類黃酮代謝物種中，其中查爾酮5 種，二氫黃酮7 種，二氫黃酮醇6種，黃酮49 種，黃酮醇38 種，黃烷醇15 種，異黃酮18 種，原花青素10 種。

圖1 正離子模式下混合樣本的質(zhì)譜分析總離子流圖Fig.1 Total ions current of mass spectrometry analysis of mixed samples positive ion mode

2.2 多元統(tǒng)計(jì)分析

為了解猴耳環(huán)嫩枝和葉組織樣本之間總體代謝差異和組內(nèi)樣本之間的變異度大小，對(duì)各樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA 分析（圖2A）。結(jié)果表明第一主成分可解釋53.96%的原始變量信息，第二和第三主成分共解釋了28.55%（PC1：12.56%，PC2：15.99%）的原始變量信息。此外猴耳環(huán)嫩枝和葉組織樣本具有一定的分離趨勢(shì)，即存在一定組間差異，說(shuō)明猴耳環(huán)嫩枝和葉中所含的代謝物成分存在一定差異。同時(shí)，同一組織部位的不同樣本也相對(duì)分散，說(shuō)明組內(nèi)樣本間也存在一定差異。PCA 是一種沒有監(jiān)督的分組方法，難以消除掉隨機(jī)誤差和組內(nèi)誤差，因此OPLS-DA 被用于更準(zhǔn)確找到猴耳環(huán)嫩枝和葉組織部位中的差異代謝物。OPLS-DA 的S-plot 圖如圖2B 所示。結(jié)果顯示猴耳環(huán)嫩枝和葉區(qū)分明顯，且很大一部分代謝物的VIP 值大于或等于1，表明這些代謝物成分在猴耳環(huán)嫩枝和葉中的含量差異顯著。

圖2 猴耳環(huán)嫩枝和葉組織樣本的多元統(tǒng)計(jì)分析Fig.2 Multivariate statistical analysis charts of Pithecellobium clypearia in different tissues

2.3 差異代謝物鑒定

根據(jù)單變量分析的差異倍數(shù)（Fold change）值和多元統(tǒng)計(jì)分析OPLS-DA 模型的VIP 值來(lái)篩選差異代謝物。選取了差異倍數(shù)大于等于2 或小于等于0.5，且VIP 值大于等于1 的代謝物認(rèn)為差異顯著。在鑒定到712 種代謝物中，393 種代謝物成分的含量在猴耳環(huán)的嫩枝和葉組織部位中沒有顯著差異。另外319 種代謝物成分則在猴耳環(huán)兩組織部位中的含量差異顯著。含量差異顯著的代謝物中，162 種在猴耳環(huán)嫩枝組織部位中的含量顯著高于葉組織，其中包含了19 種類黃酮化合物，如表1 所示。157種代謝物成分在猴耳環(huán)葉組織中的含量顯著高于嫩枝，其中包含了43 種類黃酮化合物，如表2 所示。此外，比較分析發(fā)現(xiàn)高生物活性代謝物成分如柚皮素、芹菜素、槲皮素、二氫槲皮素、表兒茶素苷和表沒食子兒茶素沒食子酸酯等在猴耳環(huán)嫩枝中的含量顯著高于葉組織。而表兒茶素、槲皮苷、楊梅苷和蘆丁等高生物活性代謝成分則在猴耳環(huán)葉組織中的含量顯著高于嫩枝。

表1 19 種在猴耳環(huán)嫩枝中含量顯著高于葉組織的類黃酮化合物Table 1 The 19 flavonoids of Pithecellobium clypearia that the content in twig were higher than in leaves

表2 猴耳環(huán)葉組織中43 種含量顯著高于嫩枝的類黃酮化合物Table 2 The 43 flavonoids of Pithecellobium clypearia that the content in leaves were higher than in twigs

2.4 差異代謝物分析

為了更方便和直觀的了解差異顯著代謝物的組織變化規(guī)律及其通路分布情況，我們對(duì)含量差異顯著的代謝物進(jìn)行了聚類和KEGG 富集分析。結(jié)果如圖3 和圖4 所示。聚類分析結(jié)果表明，大部分萜類化合物、鞣質(zhì)類、核苷酸及其衍生物和黃酮類化合物在猴耳環(huán)葉組織中含量顯著高于嫩枝。嫩枝中含量顯著高于葉組織的代謝物成分主要為脂質(zhì)類、酚酸類和氨基酸及其衍生物等化合物。KEGG 富集分析結(jié)果表明，含量差異顯著的代謝物顯著富集于纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成通路，組氨酸、精氨酸和脯氨酸代謝通路，異黃酮生物合成通路，抗壞血酸和醛酸代謝通路以及ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路。

圖3 差異代謝物聚類熱圖Fig.3 Different metabolites cluster heat map

圖4 差異代謝物KEGG 富集分析Fig.4 The KEGG enrichment analysis of differential metabolites

3 結(jié)論與討論

本研究利用UPLC—MS/MS 代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)猴耳環(huán)的主要藥用部位嫩枝和葉的代謝物成分進(jìn)行了鑒定與分析。嫩枝和葉組織中共鑒定出代謝物成分712 種。主要包括了氨基酸類、酚酸類、核苷酸及其衍生物和類黃酮等化合物。其中先前報(bào)道的槲皮素、二氫槲皮素、槲皮苷、表兒茶素、表兒茶素苷、楊梅苷和沒食子兒茶素沒食子酸酯等多種猴耳環(huán)藥效成分均被檢測(cè)到[1,3,11]，而未檢測(cè)到?jīng)]食子酸單體，很可能是因?yàn)闆]食子酸常與鞣質(zhì)和酯類等結(jié)合在一塊[10]。綜合表明UPLC—MS/MS 及其相關(guān)代謝組學(xué)技術(shù)適用于藥用植物高生物活性物質(zhì)的鑒定及新藥源分子的挖掘。先前已有相關(guān)學(xué)者利用UHPLC-MS/MS、LS-MS/MS和UHPLC -QTOF/MSE 代謝組學(xué)技術(shù)分別對(duì)黃岑Scutellaria baicalensis的不同采收期材料[18]、新疆一支蒿Artemisia rupestris的不同組織部位[19]和文冠果Xanthoceras sorbifolium的不同組織部位[20]進(jìn)行了代謝組學(xué)分析。多元統(tǒng)計(jì)、聚類和KEGG 富集分析結(jié)果顯示，猴耳環(huán)嫩枝和葉組織存在顯著代謝物成分含量差異。其中脂質(zhì)類、酚酸類和氨基酸及其衍生物主要積累于猴耳環(huán)嫩枝部位，而萜類化合物、鞣質(zhì)類和類黃酮化合物則主要積累于猴耳環(huán)的葉組織中。其中黃酮醇類化合物槲皮素在葉組織中的含量顯著高于嫩枝，這與李雪玲等人[10]的研究結(jié)果相反，這很可能是因?yàn)椴煌a(chǎn)地，不同年齡的猴耳環(huán)組織部位代謝物成分及含量有一定差異[11]。本研究?jī)H以臺(tái)山市紅嶺種子園2 a 生的猴耳環(huán)嫩枝和葉為研究材料，結(jié)果具有一定的局限性。欲系統(tǒng)全面揭示猴耳環(huán)代謝物成分及特征活性物質(zhì)在不同組織部位的分布特征及其相對(duì)含量的變化規(guī)律，為猴耳環(huán)有效部位的合理利用和開發(fā)提供重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步對(duì)不同產(chǎn)地和年份的猴耳環(huán)的多個(gè)組織部位進(jìn)行代謝組學(xué)研究。