申俊杰，李愛萍，申銘，馬國瑞

1.內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院普外科，內蒙古 呼和浩特 010050；2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院膽胰外科，湖北 武漢430030

肝臟缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI)是肝臟手術、創(chuàng)傷及失血性休克后發(fā)生肝衰竭的重要原因。目前研究認為HIRI的發(fā)生與鈣超載、細胞凋亡、內皮素及補體系統(tǒng)、代謝性酸中毒等多種因素相關[1]，因而探索新的保護HIRI的藥物至關重要。百里醌(thymoquinone，TQ)是一種具有抗氧化、抗炎癥作用的天然化合物，對糖尿病、動脈粥樣硬化的防治具有較好的效果。而且，百里醌對人正常胰腺導管上皮細胞、前列腺上皮細胞、小腸細胞等正常細胞無毒性損害[2]。前期研究發(fā)現(xiàn)，百里醌能預防HIRI，但其具體機制不明。因此，本研究將進一步探討百里醌通過抑制凋亡、抗氧化應激等改善HIRI的具體分子機制。

材料與方法

一、實驗動物

選用200～250 g重量SPF級健康雄性SD大鼠，均購自武漢大學動物實驗中心。完成該實驗所有動物操作均符合動物試驗倫理要求。

二、材料和試劑

百里醌(Sigma公司，美國)用無菌無水乙醇配制成10 mmol/L的儲存液，-20 ℃保存。Bax、Bcl-2、裂解的胱天蛋白酶(Cleaved-caspases)-3、Cleaved-caspases-9、β-actin抗體購自圣克魯斯生物技術公司。LKB1、磷酸化(p)-LKB1(Ser428)、AMPK、p-AMPK[酪氨酸(Thr)172]多克隆抗體購自美國Novus公司。丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒均購自武漢華美生物有限公司。大鼠丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)ELISA試劑盒購自美國R&D公司。肝臟細胞凋亡采用原位末端標記(TUNEL)凋亡檢測試劑盒(碧云天生物科技公司)。

三、HIRI模型

用1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉實驗鼠，參照Kohli等[3]的方法，分離肝血管和膽管，以血管夾臨時性夾閉肝左葉、肝中葉的血管，45 min后去掉血管夾，恢復肝臟血液供應，最終導致70%肝臟組織缺血再灌注損傷，缺血再灌注期間不阻斷右肝及尾狀葉血流。

四、實驗分組

將SD大鼠依照體質量編號，并采用隨機數(shù)字表法隨機分組。假手術組(Sham組，n=10)：解剖供應左肝和中肝的肝蒂，但不阻斷血流；缺血再灌注組(IRI組，n=10)：手術中血管夾封閉包含肝左葉、中葉血管的肝蒂，阻斷45 min后再灌注，縫合切口，正常飲食喂養(yǎng)24 h。百里醌預處理+肝缺血再灌注組(TQ+IRI組，各亞組n=10)：術前1周分別給予不同濃度百里醌(5、10、25、50、100 mg/kg)灌胃給藥，手術中血管夾封閉包含肝左葉、中葉血管的肝蒂，阻斷45 min后再灌注，縫合切口，正常飲食喂養(yǎng)24 h，同時繼續(xù)給予以上不同濃度百里醌灌胃。術后24 h抽取其中5只大鼠血樣，并處死實驗鼠，新鮮肝臟組織生理鹽水洗凈后液氮凍存，以備后續(xù)實驗分析；剩余5只實驗鼠繼續(xù)正常喂養(yǎng)1周后，處死并提取肝臟組織進行免疫組織化學分析。

五、ELISA檢測

術后24 h抽取實驗鼠血液，經3 000 r/min 離心10 min，分離血清，ALT、AST水平采用大鼠ALT、AST ELISA試劑盒進行測定；術后24 h處死實驗鼠，提取新鮮肝臟組織，參考GPX、GSH、SOD、MDA ELISA試劑盒操作說明書進行檢測操作與結果測定。

六、蛋白印跡法(Western blotting)

術后24 h提取實驗鼠肝臟組織，裂解液勻漿并提取組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，40 g總蛋白經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，后電轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉非特異性位點。一抗4 ℃孵育過夜，再經辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗孵育1 h，采用電化學發(fā)光(ECL)法顯色，凝膠成像系統(tǒng)采集圖片。以β-actin蛋白為內參對照，實驗均獨立重復3次。

七、組織病理學研究

取適量新鮮實驗鼠肝臟組織，預冷生理鹽水洗凈血液，于4%多聚甲醛溶液中固定48 h，石蠟包埋、切片、HE染色，顯微鏡下觀察肝臟組織的受損情況(壞死、炎性浸潤等)，采用Suzuki評分標準進行肝損傷的組織學評估。

八、Ki67免疫組織化學

大鼠在手術干預后繼續(xù)飼養(yǎng)1周，提取肝臟組織行石蠟包埋、切片并經過脫蠟、水化、抗原修復后行Ki67抗體免疫組織化學染色。以細胞核呈現(xiàn)明顯的棕黃色染色為陽性信號。每張切片在5個隨機高倍視野(×400)中進行肝細胞計數(shù)，統(tǒng)計平均陽性率，以百分數(shù)表示。

九、TUNEL染色

大鼠肝組織石蠟切片經過脫蠟、蛋白酶K及過氧化氫滅活、生物素標記及3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。每張切片在5個隨機高倍視野(×400)中進行肝細胞計數(shù)，統(tǒng)計平均陽性率，以百分數(shù)表示。

十、統(tǒng)計學方法

結 果

一、百里醌預處理對預防HIRI的效果

不同濃度梯度百里醌對SD大鼠HIRI的保護作用隨濃度增加而效果增加，在50 mg/kg濃度為最佳，其后增加百里醌濃度并無明顯肝保護效果累積，后續(xù)選取百里醌50 mg/kg為試驗濃度(圖1A、1B)。IRI組與Sham組比較，大鼠血清ALT[(171.7±11.6) U/L比(21.5±3.51) U/L，P<0.05)]、AST[(194.7±13.5) U/L比(26.4±3.97) U/L，P<0.05)]水平明顯上升，表面肝細胞受損明顯。百里醌預處理后，與Sham組比較肝臟缺血再灌注仍存在較明顯的肝細胞損傷，ALT和AST水平較Sham組有上升(P<0.05)，但TQ+IRI組與IRI組比較，ALT[(67.3 ±5.8) U/L比(171.7±11.6) U/L，P<0.05]、AST[(57.9±6.1) U/L比(194.7±13.5) U/L，P<0.05]水平明顯下調，結果初步判定百里醌能夠減輕HIRI，有效保護肝細胞(圖1A、1B)。

注：aP<0.05；與IRI組比較，bP<0.05，cP<0.01，NS.P>0.05。圖1 百里醌(TQ)預處理預防肝臟缺血再灌注損傷(IRI) A.血清丙氨酸轉氨酶(ALT)水平改變；B.天冬氨酸轉氨酶(AST)水平改變

二、各組大鼠肝組織病理學染色觀察結果

如圖2所示，在Sham組大鼠肝臟組織中，我們可以觀察到清晰的肝小葉結構，未見明顯的炎性細胞浸潤，無肝細胞壞死。而IRI組大鼠肝臟組織中，可見不同程度的肝細胞腫脹、壞死、炎性細胞浸潤，中央靜脈的淤血伴隨肝小葉結構模糊，出現(xiàn)了明顯的肝損傷表現(xiàn)。而TQ+IRI組大鼠肝臟中肝小葉結構尚清晰，炎性細胞浸潤明顯少于IRI組，肝臟細胞變性腫脹程度較輕，點狀壞死灶明顯減少。

圖2 各組大鼠肝臟組織的HE染色及病理學結果 A.假手術組(Sham組)；B.缺血再灌注組(IRI組)；C.百里醌預處理+肝缺血再灌注組(TQ+IRI組)

TUNEL染色評估大鼠肝臟細胞壞死程度，IRI組在術后24 h、7 d的TUNEL染色后凋亡指數(shù)均明顯高于TQ+IRI組(圖3，P<0.01)，7 d后相對Sham組也有顯著增高。結果表明IRI導致明顯急性慢性肝細胞壞死，百里醌預處理減少了肝臟急性損害。

注：Sham.假手術組；IRI.缺血再灌注組；TQ+IRI.百里醌預處理+肝缺血再灌注組；aP<0.05；bP<0.01。圖3 術后24 h、7 d各組大鼠肝臟組織細胞凋亡指數(shù)比較

本研究進一步采用Ki67染色來評估大鼠肝臟組織在缺血再灌注損傷后的炎性反應及肝臟細胞再生能力(Ki67可以反應細胞增殖)，如圖4所示，各組大鼠在干預24 h后提取肝臟組織并行Ki67染色，發(fā)現(xiàn)組間Ki67指數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。而IRI組術后7 d的大鼠肝臟組織中Ki67陽性肝細胞百分數(shù)明顯高于Sham組大鼠，說明肝臟中存在較多的肝細胞再生，而TQ+IRI組Ki67陽性細胞數(shù)高于IRI組，表明百里醌預處理能夠明顯促進肝臟細胞的再生。

注：Sham.假手術組；IRI.缺血再灌注組；TQ+IRI.百里醌預處理+肝缺血再灌注組；aP<0.05；bP<0.01。圖4 術后24 h、7 d各組大鼠肝臟組織Ki67染色分析

三、百里醌對HIRI中細胞氧化應激水平的影響

與Sham組比較，IRI組大鼠肝臟中GPX、SOD含量均顯著下調(圖5A～C，P<0.05)，表明缺血再灌注導致肝臟組織抗氧化應激能力下降[HIRI激活肝細胞氧化應激損傷，而氧化應激損傷是由活性氧家族(ROS)造成的，GPX、SOD是機體清除ROS的重要酶系]。TQ+IRI組大鼠肝臟組織中GPX、SOD水平較IRI組明顯上調(圖5A～C，P<0.05)，表明百里醌預處理增強肝臟細胞的抗氧化應激損傷能力。IRI組與Sham組比較，MDA含量明顯增加，百里醌預處理能顯著抑制缺血再灌注導致的肝臟組織MDA含量上升，且差異有統(tǒng)計學意義(圖5D，P<0.05)。

注：Sham.假手術組；IRI.缺血再灌注組；TQ+IRI.百里醌預處理+肝缺血再灌注組；aP<0.05。圖5 缺血再灌注損傷(IRI)后大鼠肝組織的抗氧化酶活性變化 A.谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)活性；B.谷胱甘肽(GSH)水平；C.超氧化物歧化酶(SOD)活性；D.丙二醛(MDA)水平

四、百里醌預處理、缺血再灌注對肝細胞凋亡的影響

如圖6所示，與Sham組相比，缺血再灌注后肝臟組織中大鼠促凋亡蛋白Bax的表達顯著上調、凋亡抑制蛋白Bcl-2明顯下調。TQ+IRI組大鼠肝細胞與Sham組比較，凋亡相關Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、細胞色素C蛋白表達有不同程度上調，但較IRI組顯著下降。

注：缺血再灌注組(IRI)與假手術組(Sham)比較，aP<0.05；百里醌預處理(TQ)+肝IRI組與IRI組比較，bP<0.05。圖6 蛋白印跡法分析百里醌預處理抑制肝臟缺血再灌注細胞凋亡相關蛋白變化(n=3) A.蛋白印跡法分析蛋白表達；B.蛋白表達量的相對灰度值比較分析

五、百里醌激活LKB1、AMPK信號通路抑制HIRI

如圖7所示，IRI組大鼠與Sham組比較，LKB1、AMPK蛋白表達總量無明顯改變，p-LKB1(Ser428)、p-AMPK(Thr172)水平明顯下調(P<0.05)。通過給予百里醌預處理后與IRI組及Sham組比較，肝臟組織的p-LKB1(Ser428)、p-AMPK(Thr172)蛋白磷酸化水平明顯上調，LKB1、AMPK激活明顯(TQ+IRI組比IRI組，P<0.05)。

注：Sham.假手術組；IRI.缺血再灌注組；TQ+IRI. 百里醌預處理+肝缺血再灌注組；與Sham組比較，aP<0.05；與IRI組比較，bP<0.05。圖7 蛋白印跡法分析各組大鼠肝臟組織中LKB1、p-LKB1(Ser428)、p-AMPK(Thr172)蛋白的表達(n=3) A.蛋白印跡法分析蛋白表達；B.蛋白表達量的相對灰度值比較分析

討 論

HIRI發(fā)生在肝移植、復雜的肝切除、失血性休克中，肝臟損傷程度主要歸因于長時間肝缺血和再灌注后肝損傷[4]。HIRI可分為熱缺血再灌注損傷與冷缺血再灌注損傷，熱缺血再灌注損傷多見于肝葉切除、失血性休克、靜脈閉塞性疾病等，這在臨床中更為常見和棘手。HIRI涉及眾多機制，其中肝細胞凋亡[5]、氧化應激損傷[5]、炎性反應[6-7]、肝竇Kupffer細胞代謝障礙[8]等，本研究主要評估在熱缺血再灌注損傷后肝細胞凋亡、氧化應激損傷情況。

熱缺血再灌注損傷中，肝臟ROS的大量生成和ROS清除障礙產生的氧化應激是加重肝臟損傷的重要因素，其中細胞內抗氧化酶的消耗、合成降低是主要原因。在正常生理狀態(tài)下，肝臟超氧化物可以被肝細胞各種線粒體ROS清除機制不斷消減，這些清除機制包括SOD、GSH、GPX等[9]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)百里醌預處理能調控SOD、GSH、GPX的消除過程，進而保障細胞內ROS清除效率，從而增強肝細胞的自我保護與自我修復能力。此外，脂質過氧化是引起ROS介導的HIRI的重要機制，所謂脂質過氧化，是肝細胞ROS損害細胞膜及各種酶的不飽和脂肪酸側鏈，引發(fā)脂質過氧化反應，生成大量脂質過氧化產物，從而導致細胞膜通透性增加，肝細胞結構、功能發(fā)生嚴重破壞[10]。MDA系脂質過氧化終產物，它的含量水平能間接反應組織氧化應激損傷程度。本研究中，百里醌能夠促進MDA的生成，阻斷脂質過氧化反應，減少脂質過氧化產物產量以減輕HIRI。

前期非酒精性脂肪肝大鼠模型中我們發(fā)現(xiàn)百里醌能夠激活AMPK信號。本研究通過給予百里醌預處理后肝臟組織的p-LKB1(Ser428)、p-AMPK(Thr172)蛋白磷酸化水平明顯上調，LKB1、AMPK激活明顯，這表明LKB1/AMPK的激活在百里醌預處理后的肝臟保護中發(fā)揮重要作用。目前有關HIRI的保護研究發(fā)現(xiàn)，除外類似在一項離體HIRI模型的研究中，發(fā)現(xiàn)敲除Bax基因，可明顯減輕肝細胞損傷的研究[11]，大部分集中在肝臟缺血預處理[12]、亞低溫處理[13]、硫化氫氣體或氫氣處理[14]、藥物的干預研究。而又以藥物的研究最為深入，主要涉及鈣離子通道的阻滯、炎性介質及蛋白酶異常釋放的控制、氧化應激損傷的保護、微循環(huán)的改善及中草藥提取物的研究。本研究發(fā)現(xiàn)，百里醌預處理能有效阻斷IRI的促凋亡，伴隨Bax蛋白下調、Bcl-2蛋白表達增強，有效減輕肝臟細胞凋亡。本研究還發(fā)現(xiàn)，TQ+IRI組大鼠肝細胞與Sham組比較，凋亡相關Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、細胞色素C蛋白表達有不同程度上調，但較IRI組則顯著下降，這表明百里醌預處理能在一定程度上有效阻斷缺血再灌注誘導的干細胞凋亡。

百里醌是從黑種草植物中提取的一種活性物質[2]，眾多研究已表明百里醌具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、肝臟保護、抗高血壓、降血糖、解除氣道痙攣等作用[15-18]。且百里醌安全性高，在健康小鼠中口服喂養(yǎng)百里醌，其半數(shù)致死量(LD50)高于2 400 mg/kg[19]。在毒性肝損傷模型研究中，百里醌多是通過抗氧化、抗炎、抗肝纖維化、抗肝細胞凋亡等發(fā)揮護肝作用[20]。現(xiàn)階段，關于百里醌對HIRI的研究較少，在本研究中，我們證實了百里醌預處理能夠有效預防缺血再灌注對大鼠肝臟組織的損傷，而這有可能是通過百里醌阻斷缺血再灌注誘導的肝細胞凋亡、氧化應激損傷來實現(xiàn)的，這對臨床中缺血再灌注損傷導致的肝臟、心臟、腦、腎臟等損害研究均有啟迪意義。