劉夢(mèng)麗，林欣媛，閆超雙，王方園，舒子璇，賈曉益，桂雙英,2,3,4

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物制劑研究所；3.現(xiàn)代藥物制劑安徽省教育廳工程技術(shù)研究中心；4.藥物制劑技術(shù)與應(yīng)用安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種系統(tǒng)性、自身免疫性疾病，主要病理表現(xiàn)為滑膜增生，血管翳形成，關(guān)節(jié)軟骨破壞等[1]。目前對(duì)RA的治療主要以藥物治療為主，治療藥物主要有非甾體抗炎藥、慢作用抗風(fēng)濕藥物、糖皮質(zhì)激素、生物制劑等[2]。上述藥物對(duì)于緩解臨床癥狀、控制病情進(jìn)展具有顯著優(yōu)勢(shì)，但尚不能完全治愈和降低RA的致殘率[3-4]。近年來(lái)，傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療RA愈來(lái)愈受到人們的重視。復(fù)方青風(fēng)藤巴布劑由青風(fēng)藤和桂枝經(jīng)提取制備而成[5]，青風(fēng)藤具有祛風(fēng)濕，通經(jīng)絡(luò)，利小便的功效[6]。桂枝具有發(fā)汗解肌，溫通經(jīng)脈，助陽(yáng)化氣，平?jīng)_降氣的功效[7]。二者配伍共奏祛風(fēng)除濕、溫通經(jīng)脈、散寒止痛之功效。巴布劑具有載藥量大、使用方便、無(wú)污染等特點(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用完全弗氏佐劑(Complete Freund’s Adjuvant，CFA)左后跖皮內(nèi)注射誘導(dǎo)大鼠佐劑型關(guān)節(jié)炎(Adjuvant Arthritis，AA)模型，觀察復(fù)方青風(fēng)藤巴布劑對(duì)AA大鼠的保護(hù)作用，為復(fù)方青風(fēng)藤巴布劑的進(jìn)一步研究與開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年SD大鼠48只，SPF級(jí)，雄性，體質(zhì)量160～200 g，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(皖)2017-001，動(dòng)物倫理號(hào)：AHUCM-rats-2020016。動(dòng)物均飼養(yǎng)于溫度(25±2)℃和濕度(50±10)%的屏障環(huán)境內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼養(yǎng)并自由飲水，每日光照12 h。實(shí)驗(yàn)前，適應(yīng)性飼養(yǎng)4 d以上。

1.2 主要試劑完全弗氏佐劑(Sigma，批號(hào)：SLBD0736)；戊巴比妥鈉(北京化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):061222)；青藤堿(純度≥98%，上海煦朗實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)SS105956)；氫氧化鈉(江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司，批號(hào)：20141025)；多聚甲醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20140206)；無(wú)水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20140102)；二甲苯(上海蘇懿化學(xué)試劑，批號(hào)：20140806)；蘇木精-伊紅染料(自制)；青風(fēng)藤和桂枝飲片均購(gòu)于安徽亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)楊青山副教授鑒定均為合格飲片；聚丙烯酸鈉NP-700(日本昭和公司，批號(hào)：0005488791)；甘油(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20160721)；酒石酸(汕頭市達(dá)濠化工廠(chǎng)，批號(hào)：920128)；交聯(lián)聚維酮(PVPP，安徽山河藥用輔料股份有限公司，批號(hào)：141006)；甘氨酸鋁(上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：10042001)；卡波姆(南京威爾化工有限公司，批號(hào)：20110702)；三乙醇胺(上海試劑三廠(chǎng)，批號(hào)：0815)；氮酮(鄭州津北化工有限公司，批號(hào)：20140326)；丙二醇(江西益普生藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20150501)；聚維酮K-90(PVPK-90，廣東粵美化工有限公司，批號(hào)：20160215)；生理鹽水(開(kāi)開(kāi)援生制藥有限公司，批號(hào)：14071734)。

1.3 儀器設(shè)備自動(dòng)脫水機(jī)(湖北孝感，型號(hào)：亞光ZT-12M)；石蠟包埋機(jī)(湖北孝感，型號(hào)：亞光YB-7B)：切片機(jī)(德國(guó)，型號(hào)：Leica RM2135)；切片漂烘儀(安徽合肥電子研究所科，型號(hào)：力飛QP-B)；顯微鏡(德國(guó)，型號(hào)：Olympus BXS1)；數(shù)碼照相裝置(德國(guó)，型號(hào)：Olympus DP70)。

1.4 方法

1.4.1 復(fù)方青風(fēng)藤巴布劑的制備 分別稱(chēng)取青風(fēng)藤360 g，桂枝90 g，加入6倍量90%乙醇，回流提取3次，每次1.5 h。合并提取液，減壓濃縮，干燥得干浸膏[5]。取聚丙烯酸鈉NP-700 2.5 g、甘氨酸鋁0.08 g、PVPP 0.5 g、中藥干浸膏4.2 g和氮酮1.21 g加入11 g甘油中，攪拌均勻，作為A相；另取PVP-K90 0.8 g加20 g水溶解，加入酒石酸0.08 g充分溶解，作為B相；將B相加入到A相中，攪拌均勻，取適量灘涂于無(wú)紡布上，蓋上防黏層，壓制，即得[6]。

1.4.2 青藤堿凝膠的制備 取4 g卡波姆940于純水中溶脹過(guò)夜，精密稱(chēng)取4 g青藤堿，用乙醇和丙二醇充分溶解后加入卡波姆溶液中，不斷攪拌至均勻，用三乙醇胺調(diào)pH至7.0，加純水至200 g，即得2%的青藤堿凝膠[8]。

1.4.3 AA模型建立 雄性SD大鼠48只，按體重大小編號(hào)后，隨機(jī)數(shù)表法抽取40只大鼠于左后跖皮內(nèi)注射CFA 0.1 mL制作AA模型[9]，余下8只作為空白對(duì)照組，同法注射0.1 mL生理鹽水。

1.4.4 分組與給藥 造模后第18天，用足趾容積測(cè)量?jī)x測(cè)定大鼠非致炎側(cè)足爪容積，計(jì)算非致炎側(cè)足腫脹度(腫脹度=致炎后的足容積-致炎前的足容積[10])，根據(jù)大鼠足跖腫脹度將40只AA大鼠隨機(jī)分為5組，每組8只，即模型組，復(fù)方青風(fēng)藤巴布劑高、中、低劑量組12.0、6.0、3.0 g/(kg·d)和陽(yáng)性藥組。給藥前24 h，用剃毛機(jī)剃去大鼠腹部3 cm×3 cm長(zhǎng)毛，從造模后第19天在腹部給藥，復(fù)方青風(fēng)藤巴布劑高、中、低劑量組分別貼敷不同劑量的巴布劑[11]，陽(yáng)性藥組涂抹青藤堿凝膠，模型組和空白對(duì)照組均貼敷空白基質(zhì)巴布劑，給藥1次/d，每次貼敷24 h，連續(xù)給藥7 d。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 一般情況 觀察大鼠體毛色澤，神志及活動(dòng)狀態(tài)，飲食變化等情況。

1.5.2 體重 分別于造模前(0 d)和造模后第7天、10天、13天、16天、19天、22天、25天稱(chēng)取各組大鼠的體重并記錄。

1.5.3 繼發(fā)側(cè)足爪腫脹度 分別于造模前(0 d)和造模后第7天、10天、13天、16天、19天、22天、25天用足趾容積測(cè)量?jī)x測(cè)定大鼠非致炎側(cè)足爪容積。

1.5.4 細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α 于末次給藥后12 h，腹腔3%戊巴比妥鈉麻醉，進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，靜置30 min后，離心10 min，轉(zhuǎn)速為3500 r/min，分離血清，-20 ℃冷凍保存，待測(cè)。IL-1β和TNF-α測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行。

1.5.5 病理組織學(xué)檢測(cè) 于末次給藥12 h后，處死大鼠，取踝關(guān)節(jié)置于4%多聚甲醛固定，5%硝酸脫鈣，至用針刺入組織無(wú)阻力感為止。脫水、透明、石蠟包埋、切片及蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察踝關(guān)節(jié)組織滑膜細(xì)胞增殖情況、細(xì)胞侵蝕程度、血管翳形成以及軟骨表面光滑與否。

HE染色法：石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟→水化→蘇木素染色10 min(染細(xì)胞核)→鹽酸酒精分化→伊紅染色(染細(xì)胞漿)→梯度酒精脫水→二甲苯透明→樹(shù)脂膠封片→光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠踝關(guān)節(jié)的病理表現(xiàn)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料結(jié)果以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析[6]或重復(fù)測(cè)量方差分析方法，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況造模成功的大鼠毛色較粗糙，精神倦怠，食量下降，大小便未見(jiàn)異常，注射佐劑部位的皮膚無(wú)潰爛，少許紅腫，大鼠行動(dòng)較困難，急性炎癥出現(xiàn)時(shí)以爬行為主，有舔足、抖動(dòng)的現(xiàn)象出現(xiàn)。待繼發(fā)側(cè)炎癥出現(xiàn)時(shí)，右足紅腫，但程度輕于致炎側(cè)；通過(guò)給予復(fù)方青風(fēng)藤巴布劑和青藤堿凝膠治療后，上述癥狀有所緩解。

2.2 體重在前10 d各組大鼠的體重均一致增加，從第10天開(kāi)始，除空白對(duì)照組外，其他致炎組體重均有所下降，至第16天，各致炎組大鼠體重明顯下降；自第19天開(kāi)始治療后，除模型組外，各治療組大鼠體重均有所增加，至第25天，各治療組大鼠體重明顯增加，見(jiàn)表1。

表1 大鼠體重變化情況

2.3 繼發(fā)側(cè)足爪腫脹度與空白對(duì)照組相比，在第7天和第10天，各致炎組的繼發(fā)側(cè)足腫脹度無(wú)顯著性差異(P>0.05)，第16天，各造模組繼發(fā)側(cè)的足腫脹度顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明AA大鼠模型造模成功。從第19天測(cè)完繼發(fā)側(cè)足容積后開(kāi)始給藥，與模型組相比，給藥后第4天，復(fù)方青風(fēng)藤巴布劑高劑量組和中劑量組大鼠繼發(fā)側(cè)足腫脹度明顯減輕(P<0.05)；給藥后第7天，復(fù)方青風(fēng)藤巴布劑各劑量組、陽(yáng)性藥組大鼠足腫脹度均顯著減輕(P<0.05，P<0.01)，且復(fù)方青風(fēng)藤巴布劑高劑量組的治療效果最好，優(yōu)于陽(yáng)性藥組,見(jiàn)表2。

表2 大鼠繼發(fā)側(cè)足腫脹度變化情況

2.4 細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α表達(dá)水平比較與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠血清中細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，復(fù)方青風(fēng)藤巴布劑高、中、低劑量組IL-1β、TNF-α水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中復(fù)方青風(fēng)藤巴布劑高劑量組血清中細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的水平和空白對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)，說(shuō)明高劑量組可以有效降低炎癥大鼠血清中細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的濃度至正常大鼠水平，且治療效果優(yōu)于中、低劑量組，見(jiàn)表3。

表3 大鼠血清中IL-1β和TNF-α表達(dá)水平比較

2.5 病理組織學(xué)檢測(cè)由HE染色結(jié)果可知，空白對(duì)照組大鼠均踝關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，滑膜細(xì)胞排列平整，滑膜組織未見(jiàn)增生，無(wú)細(xì)胞侵蝕，無(wú)血管翳形成；模型組大鼠均出現(xiàn)大量血管翳，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，關(guān)節(jié)軟骨受損嚴(yán)重；復(fù)方青風(fēng)藤巴布劑高劑量組大鼠均少見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和血管翳，關(guān)節(jié)軟骨表面較光滑；復(fù)方青風(fēng)藤巴布劑中、低劑量組和陽(yáng)性藥組大鼠均可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和血管翳，關(guān)節(jié)軟骨表面出現(xiàn)中度和輕度不等的受損，見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理切片圖(HE，×200)

3 討論

AA大鼠模型現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于RA發(fā)病機(jī)制及其相關(guān)藥物防治作用的研究中，是一種經(jīng)典的免疫性炎癥模型[12-13]。CFA是一種強(qiáng)大而有效的致炎劑，注射后能夠引起局部明顯且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的炎癥痛，表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛等基本炎癥反應(yīng)特征，是建立慢性炎癥痛模型最常用的藥物[14-15]。本實(shí)驗(yàn)中，大鼠左后跖皮內(nèi)注射完全弗氏佐劑后，大鼠毛色較粗糙，精神倦怠，行動(dòng)出現(xiàn)困難，并且可觀察到明顯的紅、腫癥狀，提示CFA成功誘導(dǎo)AA大鼠模型，為開(kāi)展復(fù)方青風(fēng)藤巴布劑對(duì)AA大鼠的藥效學(xué)研究提供了保障。

青藤堿是從傳統(tǒng)中藥青風(fēng)藤中提取分離的一種生物堿單體，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫抑制等藥理作用[16-17]。目前，青藤堿作為有效成分治療風(fēng)濕和類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，臨床上主要?jiǎng)┬陀衅瑒?、腸溶膠囊劑、緩釋片、靜脈注射劑等制劑[18]。青藤堿凝膠貼劑是將青藤堿制成經(jīng)皮給藥制劑，可避免口服吸收制劑的首過(guò)效應(yīng)及靜脈給藥易發(fā)生的不良反應(yīng)，增加藥物在給藥部位的濃度積累并起到持續(xù)釋藥的作用。本實(shí)驗(yàn)前期選擇腹部、踝關(guān)節(jié)兩個(gè)部位進(jìn)行考察，由于大鼠足部病變部位面積小，無(wú)法滿(mǎn)足給藥需求，并且大鼠活動(dòng)性強(qiáng)，無(wú)自覺(jué)意識(shí)，容易撕咬、掙脫巴布劑，給藥時(shí)間不能達(dá)到要求最終選擇腹部進(jìn)行貼敷給藥。在腹部貼敷不僅有充足的給藥面積，同時(shí)加以膠帶固定還可以有效地減少大鼠撕咬、掙脫等情況出現(xiàn)，保證有效給藥時(shí)間。此外，本實(shí)驗(yàn)選擇與青風(fēng)藤巴布劑具有相同給藥方式的青藤堿凝膠貼劑作為陽(yáng)性藥物所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果更能直觀、科學(xué)的反映青風(fēng)藤巴布劑的治療優(yōu)勢(shì)，為該劑型的后續(xù)研發(fā)工作提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。慢性炎癥疼痛涉及外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變，具有復(fù)雜的病理過(guò)程。大量研究表明TNF-α和IL-1β在RA發(fā)病期間發(fā)揮著不可替代的作用，TNF-α可促進(jìn)PEG、IL-1等釋放，使炎癥細(xì)胞進(jìn)入關(guān)節(jié)腔，損傷關(guān)節(jié)滑膜和關(guān)節(jié)軟骨[19]；單核和巨噬細(xì)胞可以分泌IL-1β，其可誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生，導(dǎo)致滑膜增殖，侵蝕軟骨，大量白細(xì)胞浸潤(rùn)[20-21]。本實(shí)驗(yàn)在前期課題組優(yōu)選出復(fù)方青風(fēng)藤巴布劑藥材的最佳提取工藝和復(fù)方青風(fēng)藤巴布劑的最佳基質(zhì)處方和制備工藝相關(guān)研究基礎(chǔ)上，在AA大鼠模型中考察了復(fù)方青風(fēng)藤巴布劑的抗炎作用。結(jié)果表明復(fù)方青風(fēng)藤巴布劑高劑量組可以有效地降低AA大鼠血清中TNF-α和IL-1β的濃度，并且療效優(yōu)于青藤堿凝膠(P<0.05，P<0.01)，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)制備的復(fù)方青風(fēng)藤巴布劑在治療RA方面具有一定的療效。

綜上，本研究采用CFA誘導(dǎo)AA大鼠模型證實(shí)復(fù)方青風(fēng)藤巴布劑對(duì)RA有治療作用，且可能與其抑制TNF-α和IL-1β有關(guān)，這將為復(fù)方青風(fēng)藤巴布劑的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。