亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        下調(diào)NLRP3在2型糖尿病中表達對胰島素抵抗模型脂肪細胞炎癥反應(yīng)及自噬的影響*

        2021-10-28 07:37:08沙依拉海米提阿地拉阿里木阿不拉江玉孫王新玲張穗鄉(xiāng)
        西部醫(yī)學(xué) 2021年10期
        關(guān)鍵詞:檢測模型

        沙依拉·海米提 阿地拉·阿里木 阿不拉江·玉孫 王新玲 張穗鄉(xiāng)

        (1.新疆自治區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科,新疆 烏魯木齊 830000;2.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830000)

        寡聚化結(jié)構(gòu)域樣蛋白受體3(NOD family,pyrin domain containing-3,NLRP3)是NOD家族中研究最為成熟的成員之一,同時也是生物體內(nèi)表達最為廣泛、生物作用作為多樣的一類炎性小體[1-2]。近年來大量研究證實NLRP3在2型糖尿病(type-2 diabetes mellitus disease,T2DM)的發(fā)病機制中起著至關(guān)重要的作用[3-6]。T2DM是以胰島素抵抗(insulin resistance,IR)與慢性炎癥為主要特征的代謝紊亂性疾病[7]。其中,機體的脂肪組織作為體內(nèi)最大的能量儲備系統(tǒng),其不僅在血糖控制及脂類代謝過程中發(fā)揮著重要的作用,還能通過內(nèi)分泌功能參與調(diào)節(jié)機體的免疫代謝過程[8-11]。但關(guān)于NLRP3對T2DM中發(fā)生IR的脂肪細胞的作用尚不明確。本文研究了NLRP3在脂肪細胞發(fā)生IR條件下的作用,有望為靶向NLRP3的T2DM治療提供新的啟迪。

        1 材料與方法

        1.1 研究對象 選取2018年3月~2019年5月在新疆自治區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科初診為T2DM的患者60例,設(shè)為T2DM組。另選取同期本院體檢中心的健康正常體檢者60例作為正常對照組(Normal組)。T2DM的診斷標準參考中華醫(yī)學(xué)會糖尿病分會制定的《中國2型糖尿病防治指南(2017年)》[12]。T2DM組納入標準:①符合上述糖尿病診斷標準。②無合并心腦血管、肝腎、呼吸系統(tǒng)及胃腸等其他系統(tǒng)疾病或惡性腫瘤。③非妊娠期或哺乳期婦女。④3月內(nèi)未發(fā)生酮癥酸中毒或高滲性昏迷。⑤6月內(nèi)未服用任何降糖藥物治療。本研究對象均簽署知情同意書,并經(jīng)新疆自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會審核、批準。

        1.2 細胞系及主要試劑 前脂肪細胞3T3-L1株購自中國科學(xué)院上海細胞庫;地塞米松,胰島素(insulin)、異丁基甲基黃嘌呤(isobutylmethylxanthine,IBMX)(美國Sigma公司);Trizol、BCA試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo 公司);實時定量PCR試劑盒(廣州瑞博生物公司);轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofectamine3000 (美國Invitrogen公司);靶向下調(diào)NLRP3表達的小干擾RNA(si-NLRP3)及其陰性對照序列(si-negative control,si-NC)(上海吉瑪生物公司);油紅O染色試劑盒(武漢博士德生物公司);葡萄糖氧化酶試劑盒(江蘇碧云天生物公司);大鼠抗Beclin1、GAPDH單克隆抗體(美國Santa Cruz公司);大鼠抗LC3B多克隆抗體、大鼠抗p62單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司);辣根過氧化酶標記(HRP)的兔抗大鼠IgG(武漢博士德生物科技公司);PCR引物(上海生工);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。電泳槽、電泳儀及化學(xué)發(fā)光熒光成像系統(tǒng)(美國Bio-Bad公司)。

        1.3 檢測方法

        1.3.1 生化指標檢測 所有研究對象均隔夜禁食8~10 h后采集肘靜脈血進行檢測各項生化指標。采用全自動生化分析儀檢測所有患者的血糖指標:空腹血糖值(FPG)、餐后2 h血糖(2 h PG),糖化血紅蛋白(HbA1c);。采用放射免疫法測定空腹胰島素水平(FINS)。根據(jù)FPG與FINS計算IR指數(shù)(HOMA-IR),計算公式:HOMA-IR =[(FPG×FINS)/22.5];根據(jù)受試者身高體重計算體質(zhì)量(BMI),BMI=體重(kg)/身高2(m2)。

        1.3.2 酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 參考NLRP3、白介素1β(interlukin-1β,IL-1β)、白介素18(interlukin-18,IL-18)的ELISA檢測試劑盒使用說明方法檢測相應(yīng)樣本中的上述細胞因子表達。實驗單獨進行3次。

        1.3.3 細胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 參照文獻[13]培養(yǎng)前脂肪細胞3T3-L1并誘導(dǎo)其分化為成熟脂肪細胞,方法如下:常規(guī)復(fù)蘇3T3-L1前脂肪細胞,使用含有10%FBS的DMEM/HG培養(yǎng)基進行培養(yǎng),置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長融合至90%以上時,在上述培養(yǎng)基中加入0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松、10 μg/mL Insulin進行誘導(dǎo)分化,同上條件培養(yǎng)48 h,更換為10 μg/mL Insulin與10% FBS的DMEM/HG培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h,再將培養(yǎng)基更換為10% FBS的DMEM/HG培養(yǎng)基進行持續(xù)培養(yǎng),48 h更換培養(yǎng)基1次。選擇誘導(dǎo)分化8 d至12 d的3T3-L1細胞進行成熟脂肪細胞的鑒定。

        1.3.4 油紅O染色 收集生長狀態(tài)良好的經(jīng)誘導(dǎo)分化后的3T3-L1細胞,PBS離心洗滌細胞后,在室溫下將其固定于1 mL 10%的甲醛溶液中2 h,PBS再次洗滌細胞后,室溫下晾干細胞,加入0.3%油紅染色溶液250 μl于室溫下避光染色1 h,60%異丙醇充分漂洗后置于顯微鏡下觀察,拍照。

        1.3.5 IR模型的建立 將方法1.3.3中誘導(dǎo)分化的成熟脂肪細胞3T3-L1分為正常對照組(記為A組)與IR模型組(記為B組),A組使用含10% FBS DMEM/HG的常規(guī)培養(yǎng)基進行培養(yǎng),B組使用含1 μmol/L地塞米松與10% FBS的DMEM/HG培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)IR,兩組細胞按上述條件培養(yǎng)48 h后,收集兩組細胞培養(yǎng)上清液。使用含100 nmol/L Insulin的常規(guī)培養(yǎng)基處理上述不同條件培養(yǎng)48 h后的A、B組細胞30 min,收集各組細胞培養(yǎng)上清液。參考葡萄糖氧化酶試劑盒使用方法檢測所收集的上清液中葡萄糖含量,以未接種細胞的空白培養(yǎng)基作為葡萄糖含量的基礎(chǔ)值,所測結(jié)果減去每組基礎(chǔ)值即為每組葡萄糖消耗量。

        1.3.6 細胞轉(zhuǎn)染及分組 分別取生長狀態(tài)良好的3T3-L1脂肪細胞,細胞計數(shù)后,按2×105個/mL接種于24孔板中進行IR模型誘導(dǎo)后,加入100 μl Opti-MEM溶液,并根據(jù)LipofectamineTM3000說明書方法將si-NLRP3、si-NC轉(zhuǎn)染入細胞中。將轉(zhuǎn)染后的細胞置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)8 h后即可進行檢測轉(zhuǎn)染效率及后續(xù)相關(guān)實驗。將轉(zhuǎn)染后的3T3-L1脂肪細胞分為四組,分別為si-NC組,即轉(zhuǎn)染si-NC的3T3-L1細胞;si-NLRP3組,即轉(zhuǎn)染si-NLRP3的3T3-L1細胞;IR-si-NC組,即在IR模型中轉(zhuǎn)染si-NC的3T3-L1細胞;IR-si-NLRP3組,即在IR模型中轉(zhuǎn)染si-NLRP3的3T3-L1細胞。

        1.3.7 實時熒光定量PCR(RT-PCR) 取方法1.3.6不同處理的各組3T3-L1細胞,TRIzol法提取細胞中總RNA,分光光度計檢測濃度與純度后,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,再按照RT-PCR試劑說明書及預(yù)實驗確定的反應(yīng)時間與溫度進行實時定量,RT-PCR反應(yīng)條件為:95 ℃(30 s)預(yù)變性后,變性95 ℃(7 s)→退火60 ℃(30 s)→72 ℃(15 s),40個循環(huán)周期。RT-PCR引物序列為:NLRP3-上游:5′-AGAAGAGACCACGGCAGAAG-3′,NLRP3-下游:5′-CCTTGGACCAGGTTCAGTGT-3′;GAPDH-上游:5′-GCATTGTGGAAGGGCTCATG-3′,GAPDH-下游:5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3′。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt方法分析NLRP3 mRNA的表達。上述實驗單獨重復(fù)3次。

        1.3.8 Western blot實驗 取方法1.3.6不同處理的各組3T3-L1細胞,RIPA細胞裂解液及蛋白酶抑制劑進行提取細胞中的總蛋白。BCA法進行蛋白定量后,將蛋白樣品進行加熱變性。取30 μg的蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳進行蛋白分離,采用濕轉(zhuǎn)法將分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%的脫脂牛奶于室溫下封閉2 h后,分別加入LC3B(1∶300)、Beclin1(1∶300)、p62(1∶300)、GAPDH (1∶1000)一抗,4 ℃搖床孵育過夜。TBST溶液清洗3次,5 min/次,以辣根酶標記的二抗(1∶5000)室溫孵育1 h,以TBST溶液清洗3次,5 min/次。最后均勻滴加ECL發(fā)光液后于凝膠成像儀進行曝光拍照。Image J軟件測定條帶灰度值,以目標蛋白與內(nèi)參GAPDH的比值作為其相對含量。以上實驗單獨重復(fù)3次。

        2 結(jié)果

        2.1 兩組受試者一般資料比較 T2DM組與Normal組在性別、年齡及BMI方面相比,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而FPG、2 h PG、HbA1c、FINS及HOMA-IR相比,T2DM組較Normal組均明顯增加,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05),見表1。

        表1 兩組受試者的一般臨床資料比較Table 1 General clinical data of the two groups

        2.2 NLRP3在T2DM患者血清中的表達 與Normal組相比,NLRP3在T2DM組血清中的表達顯著增加 (P<0.01),見圖1。

        圖1 NLRP3在兩組患者血清中的表達Figure 1 The expression level of NLRP3 in serum of T2DM patients increased significantly注:與Normal組相比,①P<0.01

        2.3 成熟脂肪細胞分化的鑒定 油紅O染色進行鑒定誘導(dǎo)后3T3-L1細胞,觀察顯示前脂肪細胞3T3-L1呈長梭形貼壁生成,而誘導(dǎo)后細胞形狀變圓,體積增大,經(jīng)油紅O染色觀察可見細胞核周圍有大量脂滴環(huán)繞,呈“戒環(huán)狀”。見圖2。

        圖2 油紅O染色觀察3T3-L1前脂肪細胞誘導(dǎo)分化Figure 2 Induced differentiation of 3T3-L1 pre-adipocytes was observed by oil red O staining注:黑色箭頭指示3T3-L1脂肪細胞中脂滴呈“戒環(huán)狀”

        2.4 脂肪細胞IR模型的鑒定 應(yīng)用葡萄糖氧化酶法鑒定3T3-L1細胞的IR模型,結(jié)果顯示3T3-L1脂肪細胞經(jīng)DEX培養(yǎng)48 h后與Normal組相比,IR模型組細胞的上清液中葡萄糖消耗量顯著降低 (P<0.05),再經(jīng)胰島素刺激后與Normal組相比,IR模型組細胞的上清液中葡萄糖消耗量亦明顯降低 (P<0.05)。提示成功建立了3T3-L1脂肪細胞的IR模型,見圖3。

        圖3 3T3-L1脂肪細胞IR模型的鑒定Figure 3 Identification of insulin resistance model of 3T3-L1 adipocytes注:A.Normal組;B.IR模型組。與Normal組相比,①P<0.01

        2.5 轉(zhuǎn)染si-NLRP3后IR模型中脂肪細胞對NLRP3的表達 RT-PCR結(jié)果顯示,與si-NC組相比,si-NLRP3組與IR-si-NLRP3組的3T3-L1細胞中NLRP3 mRNA的表達均顯著降低 (P<0.05),而IR-si-NC組細胞中NLRP3 mRNA的表達明顯升高 (P<0.05),提示IR能夠促進NLRP3 mRNA的表達,而轉(zhuǎn)染si-NLRP3后能夠顯著降低其表達,見圖4。

        圖4 RT-PCR檢測各組細胞中NLRP3 mRNA的表達Figure 4 The expression level of NLRP3 mRNA in each group was detected by RT-PCR注:與si-NC組細胞相比,①P<0.05

        2.6 下調(diào)NLRP3表達對IR模型中脂肪細胞炎癥因子表達的影響 ELISA檢測各組3T3-L1細胞種炎癥因子IL-1β、IL-18的表達水平,結(jié)果顯示與si-NC組相比,IR-si-NC組與IR-si-NLRP3組中IL-1β、IL-18表達均顯著增加 (P<0.05),而si-NLRP3組無顯著變化(P>0.05);與IR-si-NC組相比,IR-si-NLRP3組中IL-1β、IL-18表達均明顯降低 (P<0.05),見表2。

        表2 各組脂肪細胞對炎癥因子IL-1β、IL-18的表達Table 2 The expression of IL-1β and IL-18 in adipocytes of each group

        2.7 下調(diào)NLRP3表達對IR模型中脂肪細胞對葡糖糖攝取的影響 葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測結(jié)果顯示,與si-NC組細胞相比,IR-si-NC組與IR-si-NLRP3組中葡萄糖消耗量顯著降低 (P<0.05),而si-NLRP3組無顯著變化(P>0.05);但與IR-si -NC組相比,IR-si-NLRP3組中脂肪細胞對葡萄糖消耗量顯著增加 (P<0.05),見圖5。

        圖5 各組脂肪細胞對葡萄糖消耗量的檢測Figure 5 The detection of glucose consumption in adipocytes注:與si-NC組相比,①P<0.05;與IR-si-NC組相比,②P<0.05

        2.8 下調(diào)NLRP3表達對IR模型中脂肪細胞自噬的影響 Western blot檢測各組細胞中自噬相關(guān)蛋白LC3B與Beclin1和p62的表達,結(jié)果表明在si-NC組與si-NLRP3組3T3-L1細胞中自噬標志性分子LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1蛋白較IR-si-NC組與IR-si-NLRP3組顯著增加 (P<0.05),而p62蛋白明顯降低 (P<0.05);但與IR-si-NC組相比,IR-si-NLRP3組細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1蛋白明顯增加 (P<0.05),p62蛋白顯著降低 (P<0.05),見圖6。

        圖6 Western blot檢測各組脂肪細胞中自噬相關(guān)蛋白表達Figure 6 The expression of autophagy related proteins in adipocytes was detected by Western blot注:與si-NC組細胞相比,①P<0.05;與IR-si-NC組細胞相比,②P<0.05

        3 討論

        T2DM作為一種能量代謝障礙相關(guān)的代謝綜合征,其同樣也是一種由慢性炎癥引起的炎癥性疾病,胰島β功能損害及IR是引起T2DM的兩大重要病理特征[14]。目前T2DM在全世界范圍內(nèi)呈流行現(xiàn)象,尤其在我國,有數(shù)據(jù)報道每10個成年人中就有1個糖尿病患者,嚴重危害人們的健康及社會經(jīng)濟的發(fā)展[15]。而NLRP3作為能夠在細胞內(nèi)與凋亡相關(guān)斑點蛋白(caspase recruitment domain,ASC)和半胱氨酸蛋白酶1(caspase-1)相互結(jié)合形成具有生物活性炎性小體,并激活下游促炎因子IL-1β與IL-18等的分泌,從而參與T2DM的發(fā)生發(fā)展。同時,Oslowski團隊與Lenner團隊發(fā)現(xiàn)由代謝紊亂而引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能夠誘導(dǎo)胰島β細胞中硫氧還原蛋白相互作用蛋白的表達,而后者又能通過抑制NLRP3炎癥小體的活化及下游IL-1β的分泌,從而促進胰島β細胞的存活[16-17]。此外,大量學(xué)者在NLRP3炎性小體活化的信號通路上利用基因敲除小鼠研究證實,飲食誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體活化是引起IR及糖耐量受損的主要“幕后推手”[18-19]。本實驗通過觀察對比T2DM患者與正常對照組血清NLRP3的表達,結(jié)果表明NLRP3在T2DM患者血清中的表達異常增加,這與上述文獻的結(jié)果一致,提示NLRP3可能與T2DM的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性。

        機體脂肪細胞主要通過調(diào)控葡萄糖的運輸能力來影響脂質(zhì)的存儲及相關(guān)細胞因子的分泌,而脂肪細胞的功能障礙會造成其對胰島素的敏感性降低[20]。大量研究證實在T2DM中脂肪細胞發(fā)生了IR[9]。同時,脂肪細胞的IR將顯著降低其對葡萄糖的吸收及利用,進一步促進脂肪組織在其他組織或器官的異常累積,降低其對胰島素的敏感性,最終形成系統(tǒng)性的IR[21]。有學(xué)者報道在肥胖及高脂血癥患者的脂肪組織中NLRP3的表達較健康人群明顯增加,通過降低NLRP3炎性小體的表達能夠下調(diào)脂肪細胞對促炎因子IL-1β及IL-18表達[10-11],而IL-1β與IL-18是T2DM中重要的促炎因子[5]。本研究通過誘導(dǎo)前脂肪細胞3T3-L1分化為成熟脂肪細胞,并利用地塞米松誘導(dǎo)其形成IR模型以模擬T2DM中脂肪細胞的狀態(tài),并應(yīng)用siRNA技術(shù)下調(diào)NLRP3在脂肪細胞中的表達,ELISA實驗證實下調(diào)脂肪細胞中NLRP3的表達能顯著降低IR模型中的脂肪細胞對IL-1β、IL-18的分泌,并促進其對葡萄糖的攝取,這與其他學(xué)者的研究報道相似,均表明下調(diào)脂肪細胞中NLRP3表達能抑制其對下游IL-1β、IL-18的分泌水平,并促進其對葡萄糖的利用。

        自噬是廣泛存在于真核細胞內(nèi)的一種具有自我保護作用的生理現(xiàn)象,其基本的功能是保證細胞的活力,負責細胞器的更新。Zhang Y等[22]學(xué)者最近提出NLRP3可以通過其特殊的分子結(jié)構(gòu)域與自噬啟動蛋白Beclin1相互作用,負向調(diào)控細胞的自噬水平。在本研究中我們檢測IR模型的脂肪細胞的自噬水平,結(jié)果表明下調(diào)細胞中NLRP3表達能夠顯著促進細胞的自噬水平,同時自噬相關(guān)蛋白Beclin1表達顯著增加。LC3-Ⅰ脂質(zhì)化并形成膜結(jié)合的LC3-Ⅱ是自噬體形成的關(guān)鍵步驟,同時也被用來作為自噬發(fā)生的檢測標準,而LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ比值能夠有效反應(yīng)兩者之間的動態(tài)轉(zhuǎn)換過程。p62是細胞內(nèi)自噬過程中特異性底物及調(diào)節(jié)蛋白,同時也被用來作為衡量自噬的完成情況[23]。下調(diào)IR模型中脂肪細胞的NLRP3表達能顯著促進LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的增加及降低p62蛋白水平,這提示下調(diào)NLRP3能夠促進IR模型中脂肪細胞的自噬水平。

        4 結(jié)論

        NLRP3在T2DM中的表達顯著增加,通過下調(diào)胰島素抵抗模型中脂肪細胞NLRP3表達能夠有效降低其對炎癥因子IL-1β、IL-18的分泌,促進其對葡萄糖的攝取,并增加細胞的自噬水平。

        猜你喜歡
        檢測模型
        一半模型
        “不等式”檢測題
        “一元一次不等式”檢測題
        “一元一次不等式組”檢測題
        “幾何圖形”檢測題
        “角”檢測題
        重要模型『一線三等角』
        重尾非線性自回歸模型自加權(quán)M-估計的漸近分布
        3D打印中的模型分割與打包
        小波變換在PCB缺陷檢測中的應(yīng)用
        国产成人精品三级麻豆| 国内精品视频一区二区三区八戒| 夜夜添夜夜添夜夜摸夜夜摸| 粗了大了 整进去好爽视频| 久国产精品久久精品国产四虎 | 国产精品自拍盗摄自拍| 亚洲熟妇无码av在线播放| 国产香蕉尹人在线观看视频 | 色综合久久久久综合一本到桃花网| 亚洲女同成av人片在线观看| 日本中文字幕人妻精品| 久久免费看黄a级毛片| 中文字幕一区二区三区日韩精品| 国产香蕉尹人综合在线观| 久久少妇呻吟视频久久久| 日本一二三区在线观看视频| 一本一道波多野结衣av中文 | 欧美xxxxx精品| 少妇高潮久久蜜柚av| 妺妺窝人体色www看美女| 18禁免费无码无遮挡网站| 亚洲妇女av一区二区| 邻居美少妇张开腿让我爽了一夜 | 亚洲AVAv电影AV天堂18禁| 免费人妖一区二区三区| 日本阿v片在线播放免费| 精品国产一区二区三区久久久狼| av熟女一区二区久久| 日本熟女人妻一区二区| 成人毛片一区二区| 精品一区二区av天堂| 午夜一区二区三区免费观看| 欧美激情一区二区三区成人| 99久久免费看少妇高潮a片特黄| 国产精品,在线点播影院| 国产免费在线观看不卡| www插插插无码视频网站| 麻豆AⅤ精品无码一区二区| 手机av在线播放网站| 洲色熟女图激情另类图区| 性色av无码久久一区二区三区|