白惠玲 樊愛芳 劉勤 張書 王芃萱

1甘肅省人民醫(yī)院眼科，蘭州 730000；2甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000

葡萄膜炎病因復(fù)雜，是全球主要的致盲眼病，前葡萄膜炎是葡萄膜炎常見的類型。大多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為葡萄膜炎是由各種原因引起自身免疫功能紊亂導(dǎo)致的機(jī)體對(duì)自身抗原的免疫應(yīng)答所致，其發(fā)病機(jī)制主要與CD4+T淋巴細(xì)胞活性有關(guān)，尤其是輔助性T(T helper，Th)細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子所介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在葡萄膜炎的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用[1]。既往已有研究表明，Th細(xì)胞相關(guān)因子γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)和白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-17作為促炎因子參與葡萄膜炎的發(fā)病[2-3]；IL-4、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和IL-35作為抑炎因子參與葡萄膜炎的發(fā)病[4-6]；而IL-22則在葡萄膜炎的發(fā)病中發(fā)揮促炎及抗炎的復(fù)雜作用[7-8]。IL-9是近年被發(fā)現(xiàn)的新型細(xì)胞因子，主要由Th9細(xì)胞分泌，目前已受到越來越多研究人員的關(guān)注。多種自身免疫性疾病及相關(guān)動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，IL-9在炎性疾病過程中發(fā)揮促炎和抗炎的雙重作用[9]，但關(guān)于IL-9是否參與急性前葡萄膜炎發(fā)病的臨床報(bào)道較少。本研究擬通過分析急性前葡萄膜炎患者血清中IL-9、IFN-γ、IL-4、IL-17、TGF-β1、IL-35和IL-22的表達(dá)水平，探討IL-9與其他Th細(xì)胞相關(guān)因子在急性前葡萄膜炎發(fā)病中的作用及其相互關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用橫斷面研究方法，選取2018年5月至2019年5月在甘肅省人民醫(yī)院就診的急性前葡萄膜炎患者36例36眼，其中男20例，女16例；平均年齡(36.61±14.23)歲；等效球鏡度數(shù)為(-0.90±1.05)D。急性前葡萄膜炎診斷參考《2016年我國(guó)急性前葡萄膜炎臨床診療專家共識(shí)》[10]：(1)裂隙燈顯微鏡檢查前房?jī)?nèi)可見前房閃輝和浮游的炎性細(xì)胞，為診斷前葡萄膜炎的必要條件；(2)急性發(fā)作且持續(xù)時(shí)間少于3個(gè)月；(3)可見角膜后沉著物(keratic precipitates，KP)，呈塵狀或羊脂狀，中等大??；(4)患者有眼痛、畏光、流淚、視物模糊等癥狀。納入標(biāo)準(zhǔn)：?jiǎn)窝鄢醢l(fā)病例，符合急性前葡萄膜炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)全葡萄膜炎或中間葡萄膜炎伴發(fā)的前葡萄膜炎患者；(2)合并其他眼部疾病或有反復(fù)發(fā)作史者；(3)近1個(gè)月內(nèi)服用抗生素、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑等者；(4)合并感染性疾病者；(5)合并強(qiáng)直性脊柱炎、炎性反應(yīng)性腸道疾病等全身疾病者。同期納入體檢正常者40人40眼作為健康對(duì)照組，其中男21人，女19人；平均年齡(42.43±17.25)歲；等效球鏡度數(shù)為(-0.95±1.00)D。納入標(biāo)準(zhǔn)：無眼病及全身疾病的健康人群。排除標(biāo)準(zhǔn)：近1個(gè)月內(nèi)服用抗生素、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑等者。2個(gè)組性別構(gòu)成比、年齡、等效球鏡度數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.071，P>0.05；t=1.591，P>0.05；t=0.213，P>0.05)。本研究過程遵循《赫爾辛基宣言》，研究方案經(jīng)甘肅省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批文號(hào)：2019-204)，所有受檢者均了解本研究目的及方法，并自愿簽署知情同意書。研究期間所有受檢者的個(gè)人信息均保密。

1.2 方法

1.2.1病情嚴(yán)重程度評(píng)價(jià)方法 參照文獻(xiàn)[11] 對(duì)葡萄膜炎嚴(yán)重程度進(jìn)行分級(jí)：(1)輕度 睫狀充血，KP+～++，前房炎性細(xì)胞-～++，前房閃輝-～++；(2)中度 睫狀充血，KP++～+++，前房炎性細(xì)胞++～+++，前房閃輝++～+++；(3)重度 混合充血，KP+++～++++，前房炎性細(xì)胞+++～++++，前房閃輝+++～++++，前房纖維素性滲出，前房積膿。

1.2.2受檢者血清樣本收集 收集受檢者清晨空腹肘靜脈血各5 ml，非抗凝狀態(tài)于室溫下自然凝固后置于37 ℃溫育箱孵育1 h。離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)離心半徑17 cm，3 000 r/min離心15 min。收集血清于EP管(蘇州Axygen公司)中，封口，標(biāo)記，-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定受檢者血清IL-9及其他Th細(xì)胞相關(guān)因子質(zhì)量濃度 將血清在室溫下自然溶解，細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒在室溫中放置30 min以上。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(江蘇菲亞生物科技有限公司)以雙抗體夾心法測(cè)定受檢者血清中IL-9、IFN-γ、IL-4、IL-17、TGF-β1、IL-35、IL-22質(zhì)量濃度。按照試劑說明書完成實(shí)驗(yàn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品通過ELISA Calc軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品質(zhì)量濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用Shapiro-Wilk法進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，證實(shí)年齡和等效球鏡度數(shù)滿足正態(tài)分布，以mean±SD表示，血清中細(xì)胞因子數(shù)據(jù)資料呈偏態(tài)分布，以M(Q1，Q3)表示；性別分布為計(jì)數(shù)資料，以頻數(shù)表示。急性前葡萄膜炎組與健康對(duì)照組間年齡和等效球鏡度數(shù)差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，患者性別分布差異比較采用χ2檢驗(yàn)。2個(gè)組受檢者血清各細(xì)胞因子質(zhì)量濃度差異比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；不同程度前葡萄膜炎組患者血清中IL-9質(zhì)量濃度總體差異比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；血清中IL-9質(zhì)量濃度與其他Th細(xì)胞因子質(zhì)量濃度間的關(guān)系評(píng)估采用Spearman秩相關(guān)分析，并對(duì)相關(guān)系數(shù)進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2個(gè)組間IL-9及其他Th細(xì)胞相關(guān)因子質(zhì)量濃度比較

與健康對(duì)照組比較，急性前葡萄膜炎組患者血清中IL-9、IFN-γ、IL-4、TGF-β1、IL-35、IL-22質(zhì)量濃度均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；急性前葡萄膜炎組與健康對(duì)照組間血清中IL-17質(zhì)量濃度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=704.500，P>0.05)(表1)。

表1 2個(gè)組受檢者IL-9及其他Th細(xì)胞相關(guān)因子質(zhì)量濃度比較[M(Q1,Q3),ng/L?Table 1 Comparison of IL-9 and other Th cell-related cytokines concentrations between the acute anterior uveitis group and healthy control group [M(Q1,Q3),ng/L?組別眼數(shù)IL-9IFN-γIL-4IL-17急性前葡萄膜炎組3671.68(54.01,104.46)637.81(307.38,845.06)761.50(657.19,980.22)55.71(34.47,73.88)健康對(duì)照組4051.17(44.45,60.32)310.33(170.92,571.42)469.86(380.75,806.05)57.51(48.23,68.40)U值1 043.500981.5001 075.500704.500P值0.0010.007<0.010.872組別眼數(shù)TGF-β1IL-35IL-22急性前葡萄膜炎組36822.48(623.37,1 202.09)77.29(48.03,106.95)146.88(124.96,211.09)健康對(duì)照組40695.95(507.03,826.20)62.06(44.36,79.70)103.93(78.13,134.04)U值1 030.000970.5001 080.000P值0.0010.009<0.01 注:(Mann-Whitney U檢驗(yàn)) IL:白細(xì)胞介素;Th:輔助性T;IFN-γ:γ干擾素;TGF:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 Note:(Mann-Whitney U test) IL:interleukin;Th:T helper;IFN-γ:interferon-γ;TGF:transforming growth factor

2.2 急性前葡萄膜炎不同嚴(yán)重程度組患者血清中IL-9質(zhì)量濃度比較

疾病嚴(yán)重程度分級(jí)結(jié)果顯示，急性前葡萄膜炎患者輕度組、中度組和重度組IL-9質(zhì)量濃度分別為57.24(47.47，65.10)、71.68(67.55，78.91)和114.01(74.78，139.30)ng/L，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=8.766，P=0.012)，其中輕度組和中度組受檢者血清中IL-9質(zhì)量濃度均明顯低于重度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

2.3 急性前葡萄膜炎患者血清中IL-9質(zhì)量濃度與其他Th細(xì)胞相關(guān)因子質(zhì)量濃度的相關(guān)性

急性前葡萄膜炎患者血清中IL-9質(zhì)量濃度與IL-17、TGF-β1、IL-35質(zhì)量濃度變化均呈正相關(guān)(rs=0.449，P=0.006；rs=0.517，P=0.001；rs=0.400，P=0.016)，與IFN-γ、IL-4、IL-22無明顯相關(guān)性(rs=0.293，P=0.078；rs=0.286，P=0.091；rs=0.316，P=0.06)(圖1)。

圖1 急性前葡萄膜炎患者血清中IL-9與IL-17、TGF-β1、IL-35質(zhì)量濃度相關(guān)性分析(Spearman秩相關(guān)分析，n=36) A：IL-9質(zhì)量濃度與IL-17質(zhì)量濃度呈正相關(guān)(rs=0.449，P=0.006) B：IL-9質(zhì)量濃度與TGF-β1質(zhì)量濃度呈正相關(guān)(rs=0.517，P=0.001) C：IL-9質(zhì)量濃度與IL-35質(zhì)量濃度呈正相關(guān)(rs=0.400，P=0.016) IL：白細(xì)胞介素；TGF：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子Figure 1 Correlation analysis between concentration of serum IL-9 and IL-17,TGF-β1,IL-35(Spearman rank correlation analysis,n=36) A:Serum IL-9 concentration was positively correlated with IL-17 concentration (rs=0.449,P=0.006) B:Serum IL-9 concentration was positively correlated with TGF-β1 concentration (rs=0.517,P=0.001) C:Serum IL-9 concentration was positively correlated with IL-35 concentration (rs=0.400,P=0.016) IL:interleukin；TGF:transforming growth factor

3 討論

葡萄膜炎是臨床常見的眼部炎性疾病，可對(duì)眼組織造成不可逆損害。自身免疫性葡萄膜炎主要由CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)。初始CD4+T細(xì)胞識(shí)別特異性抗原后活化，進(jìn)一步分化為不同T細(xì)胞亞群，主要包括Th1、Th2、Th17、Tfh、Th9、Th22、Treg等。不同CD4+T細(xì)胞亞群表達(dá)不同的特異性轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子，參與不同類型的免疫應(yīng)答或調(diào)節(jié)免疫[12]。

Th1細(xì)胞被認(rèn)為是葡萄膜炎發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞群，其標(biāo)志性細(xì)胞因子為IFN-γ，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答并參與自身免疫性疾病的組織損傷，與器官特異性自身免疫性疾病、慢性遷延性炎癥等有關(guān)。本研究中IFN-γ在急性前葡萄膜炎組患者血清中的質(zhì)量濃度較健康對(duì)照組明顯升高，表現(xiàn)出其致炎的作用機(jī)制，與既往研究結(jié)果一致[2]。Th2細(xì)胞分泌的IL-4抑制Th1細(xì)胞表達(dá)IFN-γ，Treg細(xì)胞分泌的TGF-β1、IL-10、IL-35抑制各T細(xì)胞亞群的應(yīng)答，因此Th2細(xì)胞和Treg細(xì)胞可在一些Th1細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病中發(fā)揮抑制效應(yīng)，并在疾病的活動(dòng)期呈低表達(dá)狀態(tài)，其高水平表達(dá)與疾病緩解期顯著相關(guān)[4-6]。本研究發(fā)現(xiàn)急性前葡萄膜炎患者血清中IL-4、TGF-β1、IL-35質(zhì)量濃度較健康對(duì)照明顯升高，可能與患者病程處于緩解期有關(guān)。既往研究報(bào)道，Th17細(xì)胞能分泌多種致炎因子，在葡萄膜炎的發(fā)病過程中發(fā)揮促炎作用，IL-17是Th17細(xì)胞免疫效應(yīng)的標(biāo)志性細(xì)胞因子[3]。本研究結(jié)果顯示，急性前葡萄膜炎患者血清中IL-17質(zhì)量濃度并未升高，而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎小鼠血清中IL-17的表達(dá)呈現(xiàn)雙峰樣曲線[13]，因此本研究中患者血清中IL-17質(zhì)量濃度并未升高的原因可能與部分患者處于疾病中間病程有關(guān)。Li等[8]研究顯示，葡萄膜炎患者外周血單核細(xì)胞中IL-22呈高表達(dá)，與本研究急性前葡萄膜炎患者血清中IL-22質(zhì)量濃度高于健康對(duì)照的研究結(jié)果一致。

Th9細(xì)胞是近年來發(fā)現(xiàn)的CD4+Th細(xì)胞亞群，其在炎癥性疾病中的作用受到越來越多的關(guān)注，成為自身免疫性疾病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。初始CD4+T細(xì)胞受抗原刺激后在TGF-β1和IL-4的作用下向Th9細(xì)胞分化[14]，其特征在于高水平分泌IL-9。除Th9細(xì)胞外，其他多種細(xì)胞也可產(chǎn)生IL-9，包括Th2細(xì)胞、Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞、肥大細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞。IL-9在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、特應(yīng)性皮炎、結(jié)腸炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、系統(tǒng)性硬化癥、變態(tài)反應(yīng)性炎癥、1型糖尿病和多發(fā)性硬化癥等自身免疫性疾病的病理生理過程中起關(guān)鍵作用[15-27]。然而，IL-9在葡萄膜炎中的作用研究報(bào)道較少。Nouri-Vaskeh等[28]對(duì)32例白塞病患者與56例健康對(duì)照者血清中IL-9水平進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，二者無顯著差異，并且血清中IL-9水平與白塞病的臨床特征和疾病嚴(yán)重程度無明顯相關(guān)性。Peng等[29]研究表明，IL-9參與小柳原田病的發(fā)病機(jī)制，并且IL-9還可以通過增加IL-17的分泌來增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，急性前葡萄膜炎患者血清中IL-9質(zhì)量濃度升高，且與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，提示IL-9可能促進(jìn)急性前葡萄膜炎的炎癥過程，是急性前葡萄膜炎病程中重要的細(xì)胞因子。此外，本研究結(jié)果顯示急性前葡萄膜炎患者血清中IL-9與Th17細(xì)胞分泌的IL-17、Treg細(xì)胞分泌的TGF-β1和IL-35質(zhì)量濃度均呈正相關(guān)，與血清中Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ、Th2細(xì)胞分泌的IL-4、Th22細(xì)胞分泌的IL-22質(zhì)量濃度均無明顯相關(guān)性，提示IL-9的作用與Th17、Treg細(xì)胞密切相關(guān)。IL-9可與Th17細(xì)胞分泌的促炎因子發(fā)揮協(xié)同作用，也可促進(jìn)Treg細(xì)胞的免疫抑制活性，導(dǎo)致效應(yīng)T細(xì)胞減少，保護(hù)機(jī)體不受外界危險(xiǎn)信號(hào)的影響[30-31]。

綜上所述，IL-9在急性前葡萄膜炎的病程中可能具有促進(jìn)免疫炎癥反應(yīng)的作用，其與Th1、Th2、Th17、Th22、Treg細(xì)胞密切相關(guān)，它們之間共同構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系來發(fā)揮免疫效應(yīng)。因此，抗IL-9療法可能減輕患者自身免疫性疾病的嚴(yán)重程度，對(duì)于急性前葡萄膜炎患者，IL-9的靶向治療可能成為未來的研究方向，但由于上述細(xì)胞之間相互調(diào)節(jié)的復(fù)雜性，在實(shí)際治療過程中不能只考慮某種單一因素，而需要多種因素相結(jié)合來達(dá)到治療的目的。本研究樣本量較小，對(duì)于這些細(xì)胞及其因子的作用機(jī)制及其之間的相關(guān)關(guān)系仍需要進(jìn)一步收集大樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突