閔鵬飛，千慧燕，楊冰祎，宋建臣，賈立軍*,劉德志

1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系，吉林延吉 133000；2.吉林省磐石市富太鎮(zhèn)畜牧服務(wù)站，吉林磐石132307

葡萄球菌是一種非常常見的人獸共患病原菌，隸屬于芽孢桿菌目細(xì)球菌科葡萄球菌屬，細(xì)菌形態(tài)通常為圓形或卵圓形，常呈葡萄串狀排列，無芽孢，無鞭毛，無莢膜。革蘭氏染色陽性。近期吉林省延邊朝鮮族自治州某熊場發(fā)現(xiàn)一只不明原因死亡的黑熊。經(jīng)過現(xiàn)場的初步診斷與勘察，并結(jié)合該死亡黑熊生前的臨床癥狀、現(xiàn)場的初步解剖結(jié)果判斷，懷疑該死亡黑熊生前很可能感染疑似葡萄球菌的病原菌。為進(jìn)一步確定病因、診治和預(yù)防黑熊的傳染性疾病。本研究利用實(shí)驗(yàn)室診斷方法進(jìn)行了分離純化、生物化學(xué)鑒定、16S rRNA分子鑒定等操作。通過上述實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)再結(jié)合臨床癥狀以及解剖結(jié)果，我們最終確定該菌株為金黃色葡萄球菌。本試驗(yàn)的順利進(jìn)行對葡萄球菌的研究工作做出了一定貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

此次試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)動物來自于延邊某熊場，現(xiàn)場采集死亡黑熊的肝臟、脾臟等實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 主要試劑

生化鑒定管、營養(yǎng)瓊脂、藥敏紙片、質(zhì)粒小提試劑盒、生化試劑管、血瓊脂平板、革蘭氏染色液等。細(xì)菌16S rRNA通用引物由生工生物技術(shù)有限公司合成。其它實(shí)驗(yàn)所用到的試劑均由延邊大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 細(xì)菌的分離純化

將熊場采集的黑熊臟器放置于超凈工作臺上進(jìn)行進(jìn)一步處理。用接種環(huán)取樣后，分別劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂平板培養(yǎng)基和高鹽甘露醇培養(yǎng)基。將上述培養(yǎng)基放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h后用接種環(huán)挑取培養(yǎng)基上生長良好的單個菌落,接種于3 mL的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃震蕩培養(yǎng)一夜后進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1.4 細(xì)菌的染色及形態(tài)觀察

使用革蘭氏染色法對分離菌株進(jìn)行染色,并將染色后的載玻片放置于顯微鏡下觀察。

1.5 細(xì)菌的生化鑒定

將純化后的細(xì)菌制作成細(xì)菌懸液。準(zhǔn)備五個試管，用記號筆分別做好標(biāo)記，依次向五個試管中加入葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇五種糖溶液，并向五個試管中滴加0.4%的溴麝香草酚藍(lán)作為指示劑。將配置好的細(xì)菌懸液滴入五個試管中，每管3滴。用封口膜封口，封口膜用75%酒精擦拭滅菌，接種完后放36±1 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

1.6 16S rRNA分子鑒定

采用DNA提取試劑盒說明書對該菌株的DNA進(jìn)行提取,運(yùn)用細(xì)菌16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR鑒定。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。選取PCR陽性產(chǎn)物進(jìn)行測序，將測序結(jié)果提呈NCBI進(jìn)行對比。

1.7 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

將氧氟沙星、復(fù)方磺胺甲唑、頭孢呋辛、萬古霉素、慶大霉素五種藥物的藥敏紙片放置于培養(yǎng)皿上，紙片之間距離應(yīng)該大致相等。為使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確，應(yīng)進(jìn)行至少5組以上的實(shí)驗(yàn)，放好紙片后，將所有的培養(yǎng)皿倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，24 h后觀察結(jié)果。

1.8 小鼠致病性實(shí)驗(yàn)

取10只健康的1月齡昆明鼠，分成兩個組，第一組5只昆明鼠分別腹腔注射0.5 mL提取完成的細(xì)菌懸液并做好標(biāo)記。另一組5只昆明鼠分別腹腔注射0.5 mL的生理鹽水作為對照組并做好標(biāo)記。兩組小鼠分放在10個鼠籠飼養(yǎng)，飼料、飲水、溫度等飼養(yǎng)條件均相同。每日定期觀察實(shí)驗(yàn)小鼠的死亡情況并做好紀(jì)錄。

2 結(jié)果

2.1 剖檢變化

死亡黑熊生前體溫升高，呼吸次數(shù)及頻率加快并伴隨腹瀉。排出黑色、水樣稀便,全身皮膚顏色以及性狀發(fā)生改變。剖檢可見死亡黑熊肝臟表面出現(xiàn)灰白色的壞死點(diǎn),脾臟、腎臟不同程度腫大，有紫黑色的出血點(diǎn)。

2.2 分離菌的培養(yǎng)及染色結(jié)果

分離所得的菌株，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，生成表面濕潤光滑的圓形菌落，呈現(xiàn)淺黃色直徑1～2 mm斑點(diǎn)狀凸起。在血瓊脂平板培養(yǎng)基形成金黃色、圓形、濕潤凸起的大型菌落，菌落周圍可見透明的溶血環(huán)。高鹽甘露醇培養(yǎng)基的菌落形態(tài)與營養(yǎng)瓊脂平板的菌落形態(tài)大致相同。顯微鏡下可觀察到分離菌為革蘭氏陽性球菌，染色為藍(lán)紫色，無芽孢、無菌毛、無鞭毛。呈單個或多個聚集排列。多個細(xì)菌聚集時細(xì)菌形態(tài)類似于葡萄串狀。

2.3 生化鑒定結(jié)果

五個試管顏色全部變?yōu)辄S色，說明分離菌株分解葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇。且分離菌株分解上述五種糖后產(chǎn)生酸性物質(zhì)但是不產(chǎn)生氣體。

表格1 生化鑒定結(jié)果

2.4 PCR鑒定結(jié)果

將測序后得到的序列于NCBI上比對后發(fā)現(xiàn)，分離菌株的16s rRNA與金黃色葡萄球菌的16s rRNA核苷酸同源性為100%。

2.5 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

除復(fù)方磺胺甲唑藥敏紙片周圍幾乎不出現(xiàn)抑菌環(huán)外，其它種類的藥敏紙片周圍都出現(xiàn)大小不一的抑菌環(huán)。由此可以推斷出，分離菌株對大多數(shù)種類的抗生素敏感性較強(qiáng)，對磺胺類藥物的敏感性較弱。

2.6 小鼠致病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組小鼠接種細(xì)菌懸液后表現(xiàn)明顯，初期癥狀為精神沉郁，被毛凌亂，食欲減退。第3天開始陸續(xù)出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，第5天實(shí)驗(yàn)組小鼠全部死亡。將小鼠臟器中分離的細(xì)菌鏡檢，結(jié)果與黑熊體內(nèi)分離出的細(xì)菌形態(tài)一致。由此可說明黑熊體內(nèi)分離出的細(xì)菌對小鼠有很強(qiáng)的致病性。

3 討論

相關(guān)文獻(xiàn)證明，金黃色葡萄球菌感染可以導(dǎo)致牛、羊身體多處淋巴結(jié)腫大且肝、腎等不同程度病變[1,2]。細(xì)菌培養(yǎng)以及革蘭氏染色結(jié)果可表明該分離菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上可以生成光滑的S型菌落。且血瓊脂平板及高鹽甘露醇培養(yǎng)結(jié)果表明，分離菌具有高強(qiáng)度的耐鹽性和溶血性。革蘭氏染色結(jié)果表明分離菌為革蘭氏陽性球菌，細(xì)菌排列形狀與葡萄球菌排列形狀基本相同。根據(jù)相關(guān)學(xué)者的研究[3]，金黃色葡萄球菌對青霉素的耐藥率可以高達(dá)90.91%，且金黃色葡萄球菌對于磺胺類藥物最不敏感。最終生化及PCR結(jié)果證實(shí)，分離菌的生化鑒定結(jié)果與金黃色葡萄球菌生化鑒定結(jié)果高度相似。16s rRNA結(jié)果顯示分離菌核苷酸同源性與金黃色葡萄球菌核苷酸同源性為100%。小鼠致病性實(shí)驗(yàn)表明，分離菌株對昆明鼠有很強(qiáng)的致病性。綜上所述，我們可以證實(shí)此次從死亡黑熊體內(nèi)分離出來的細(xì)菌為金黃色葡萄球菌。

本次實(shí)驗(yàn)的成功進(jìn)行對國內(nèi)金黃色葡萄球菌的研究工作做出了補(bǔ)充與完善，為今后金黃色葡萄球菌的研究提供了較為詳細(xì)的資料。尤其對未來東北地區(qū)特別是延邊地區(qū)黑熊熊源葡萄球菌病的防治工作具有重要意義，對東北地區(qū)的黑熊養(yǎng)殖業(yè)做出了巨大的貢獻(xiàn)。