穆楊，羅凌波，楊菁

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，武漢 430060)

睪丸支持細(xì)胞為精子細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支持，參與構(gòu)成血睪屏障和生精微環(huán)境，并發(fā)揮旁分泌作用，在精子的免疫豁免以及成熟中發(fā)揮重要作用。肥胖會(huì)破壞血睪屏障，損害睪丸支持細(xì)胞功能，進(jìn)而損害男性的生育力[1-5]；睪丸局部游離脂肪酸水平過(guò)高，會(huì)刺激睪丸支持細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)多的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，這些不穩(wěn)定基團(tuán)攻擊生物膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞DNA，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖患者睪酮水平顯著下降[6-7]，使用睪酮替代療法可增加人體的血清睪酮水平[8]，并抑制生精細(xì)胞的凋亡[9]；睪酮可抑制睪丸支持細(xì)胞的氧化損傷[10]。然而，睪酮對(duì)肥胖導(dǎo)致的睪丸支持細(xì)胞受損是否具有保護(hù)作用，目前仍未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。本研究以棕櫚酸(palmitic acid，PA)體外刺激模擬體內(nèi)的高脂環(huán)境處理小鼠睪丸支持細(xì)胞系(TM4)建立體外細(xì)胞損傷模型，評(píng)價(jià)睪酮對(duì)支持細(xì)胞的保護(hù)性作用。

材料與方法

一、主要實(shí)驗(yàn)材料及試劑

TM4小鼠睪丸支持細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American type culture collection，ATCC)。睪酮購(gòu)自愛(ài)必信(上海)生物科技有限公司(貨號(hào)abs816670)；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK8檢測(cè)試劑盒購(gòu)于日本同仁化學(xué)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物技術(shù)有限公司；抗Occludin兔單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam。其余所有實(shí)驗(yàn)試劑的純度均為國(guó)產(chǎn)分析純。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.TM4細(xì)胞培養(yǎng)：將TM4細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.細(xì)胞分組處理：將上述TM4細(xì)胞分為3組，分別為對(duì)照組、PA模型組(PA組)、PA模型睪酮干預(yù)組(睪酮+PA組)。PA組僅采用PA干預(yù)，PA模型睪酮干預(yù)組為PA及睪酮共同干預(yù)。PA干預(yù)濃度為1 mmol/L[11]，睪酮干預(yù)濃度為2 μg/ml[10]。PA和睪酮均采用0.1% DMSO配制。對(duì)照組加入等量等濃度的DMSO作為對(duì)照。

3.細(xì)胞存活率檢測(cè)：將TM4細(xì)胞種在96孔板上，按照上述實(shí)驗(yàn)分組處理24 h后，使用CCK8試劑盒檢測(cè)TM4細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以對(duì)照組細(xì)胞存活率作為100%，計(jì)算各組細(xì)胞相對(duì)存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。

4.RT-PCR檢測(cè)：用0.25%胰蛋白酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TM4細(xì)胞，制成5×104/ml的細(xì)胞懸液；將TM4細(xì)胞接種在6孔板上，DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，去除培養(yǎng)基，PBS清洗3次，將細(xì)胞分為3組：對(duì)照組、PA組、睪酮+PA組，PA干預(yù)濃度為1 mmol/L，睪酮干預(yù)濃度為2 μg/ml，處理24 h后加入Trizol(Takara，日本)用于提取細(xì)胞總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒在20 μl RNA反轉(zhuǎn)錄體系中反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。使用cDNA樣本配制實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系，使用實(shí)時(shí)定量PCR儀檢測(cè)Occludin、ZO-1以及核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2)、血紅素加氧酶(heme oxygenase-1，HO-1)、CAT和NAD(P)H脫氫酶(NAD(P)H dehydrogenase quinone 1，NQO1)的mRNA表達(dá)水平。引物由上海生工合成，引物序列見(jiàn)表1。以GAPDH為內(nèi)參，利用2-ΔΔCt方法分析mRNA相對(duì)表達(dá)。

表1 RT-PCR引物

5.Western-blot檢測(cè)：取不同處理方案干預(yù)24 h的TM4細(xì)胞用PBS清洗3次并加入RIPA細(xì)胞裂解液，4℃超聲裂解，離心30 min，離心后吸取上清液并采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。使用SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)，在轉(zhuǎn)膜封閉后使用Occludin單克隆抗體(稀釋比1∶1 000)和GAPDH單克隆抗體(1∶10 000，Abcam，英國(guó))4℃孵育過(guò)夜，次日TBS清洗，二抗常溫孵育2 h，TBS清洗后顯色。利用凝膠自動(dòng)分析成像系統(tǒng)(ECL，Bio-Rad，美國(guó))對(duì)蛋白條帶進(jìn)行采集和灰度值分析，GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

6.SOD和CAT活性及GSH含量的檢測(cè)：將TM4細(xì)胞按照前述干預(yù)培養(yǎng)24 h后，使用胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，4 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞超聲裂解后，4℃、1 200g離心5 min，取上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定SOD和CAT活性，同時(shí)測(cè)定GSH含量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表述，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、TM4細(xì)胞存活率的改變

PA組TM4細(xì)胞存活率較對(duì)照組顯著降低[(52.1±3.3)% vs.(100.0±11.9)%，P<0.05]，而睪酮干預(yù)之后(睪酮+PA組)細(xì)胞存活率較PA組顯著升高[(82.9±6.4)% vs.(52.1±3.3)%，P<0.05](圖1)。

以對(duì)照組細(xì)胞存活率為100%的各組細(xì)胞相對(duì)存活率；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與PA組比較，#P<0.05圖1 不同處理組TM4細(xì)胞存活率的改變(n=6)

二、血睪屏障的主要連接分子Occludin和ZO-1的表達(dá)改變

與對(duì)照組相比，PA處理后TM4細(xì)胞中Occludin和ZO-1的mRNA表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)；與PA組相比，睪酮干預(yù)后(睪酮+PA組)Occludin和ZO-1的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)(圖2)。

A：Occludin；B：ZO-1；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與PA組比較，#P<0.05圖2 不同處理組TM4細(xì)胞中血睪屏障主要連接因子的mRNA表達(dá)(n=6)

隨后，我們進(jìn)一步檢測(cè)了Occludin的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，PA刺激可顯著降低Occludin的蛋白表達(dá)水平(P<0.05)；與PA組相比，睪酮處理后(睪酮+PA組)Occludin蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)(圖3)。

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與PA組比較，#P<0.05圖3 不同處理組TM4細(xì)胞中Occludin 蛋白表達(dá)(n=6)

三、SOD和CAT活性以及GSH含量的改變

與對(duì)照組相比，PA處理后TM4細(xì)胞SOD和CAT活性顯著降低，GSH含量顯著降低(P<0.05)；與PA組相比，睪酮干預(yù)之后(睪酮+PA組)SOD和CAT活性顯著升高，GSH含量顯著升高(P<0.05)(圖4)。

A：SOD活性；B：CAT活性；C：GSH含量；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與PA組比較，#P<0.05圖4 不同處理組TM4細(xì)胞中SOD和CAT活性以及GSH含量(n=6)

四、抗氧化基因的改變

與對(duì)照組相比，PA處理后TM4細(xì)胞內(nèi)Nrf2、HO-1、CAT和NQO1的mRNA水平下調(diào)(P<0.05)；與PA組相比，睪酮干預(yù)之后(睪酮+PA組)上述指標(biāo)的mRNA水平均有所升高(P<0.05)(圖5)。

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與#PA組比較，P<0.05圖5 不同處理組TM4細(xì)胞中抗氧化基因的mRNA表達(dá)水平(n=6)

討 論

本實(shí)驗(yàn)采用PA處理TM4細(xì)胞模擬肥胖導(dǎo)致的生殖細(xì)胞脂毒性，發(fā)現(xiàn)PA處理后TM4支持細(xì)胞的存活率顯著下降，血睪屏障蛋白Occludin和ZO-1表達(dá)下調(diào)。以此為體外細(xì)胞損傷的模型，發(fā)現(xiàn)睪酮干預(yù)可增加細(xì)胞存活率和屏障蛋白Occludin和ZO-1的表達(dá)。此外，睪酮可增加TM4細(xì)胞的抗氧化基因的表達(dá)，上調(diào)抗氧化酶的活性。因此，睪酮對(duì)睪丸支持細(xì)胞具有保護(hù)性作用。

氧化應(yīng)激在肥胖導(dǎo)致的男性生精功能受損中發(fā)揮了重要作用[2，12-14]。我們前期研究也表明，氧化應(yīng)激致細(xì)胞凋亡、自噬激活、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是肥胖性生精功能受損的重要機(jī)制[11，15-16]。氧化應(yīng)激的過(guò)度激活不僅會(huì)對(duì)精子細(xì)胞產(chǎn)生直接損害，還可通過(guò)影響睪丸間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞的功能，間接地影響精子發(fā)生[17-18]。本研究中，PA處理TM4細(xì)胞建立細(xì)胞損傷模型，抗氧化酶SOD和CAT的活性下調(diào)，GSH含量降低，提示TM4遭受氧化損傷，細(xì)胞內(nèi)氧化還原體系被破壞。Nrf2信號(hào)通路是最重要的抗氧化轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子之一。當(dāng)細(xì)胞遭受刺激時(shí)，Nrf2由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄到核內(nèi)，轉(zhuǎn)錄合成下游抗氧化因子HO-1和NQO1等發(fā)揮抗氧化作用；PA處理后，TM4細(xì)胞內(nèi)Nrf2、HO-1、NQO1表達(dá)均下調(diào)，提示Nrf2通路的受損可能是肥胖小鼠TM4細(xì)胞功能障礙的機(jī)制之一。

研究發(fā)現(xiàn)，睪酮可以抑制體內(nèi)的多種促炎癥因子的產(chǎn)生[19-21]，減輕C2C12骨骼肌細(xì)胞的凋亡[22]；睪酮治療可有效提高肥胖糖尿病小鼠胰島素的反應(yīng)性[23]。睪酮可以有效激活衰老肝臟中的Nrf2信號(hào)通路，抑制衰老相關(guān)的氧化損傷[24]。雖然睪酮可以通過(guò)多種途徑發(fā)揮保護(hù)作用，但是其對(duì)肥胖導(dǎo)致的睪丸支持細(xì)胞功能受損的具體作用，目前仍未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，PA損傷模型經(jīng)睪酮干預(yù)之后，TM4細(xì)胞存活率增加，血睪屏障的主要連接分子Occludin和ZO-1表達(dá)上調(diào)。同時(shí)，抗氧化酶活性增加，Nrf2等基因表達(dá)上調(diào)。這提示，睪酮保護(hù)支持細(xì)胞免于PA損傷可能是通過(guò)增強(qiáng)其抗氧化的作用。

本研究尚有不足：僅針對(duì)睪丸支持細(xì)胞組成血睪屏障的功能進(jìn)行了研究，對(duì)抑制素B和雄激素受體的表達(dá)未進(jìn)行檢測(cè)，睪酮在此方面的作用仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究加以證實(shí)。本研究結(jié)論目前僅建立在細(xì)胞模型的體外實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)之上，尚需要進(jìn)一步的動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，從而為可能的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)條件下外源性睪酮可提高體外培養(yǎng)支持細(xì)胞的抗氧化酶活性，改善PA誘導(dǎo)的細(xì)胞功能損傷，起到細(xì)胞保護(hù)的作用。我們的研究為肥胖性男性不育的治療提供了新的思路。