饒群，白劍，胡丹，楊殊琳

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，武漢 430000)

生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域往往采用形態(tài)學(xué)評(píng)分來(lái)決定胚胎移植順序。目前應(yīng)用比較廣泛的囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)是1999年Gardner評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[1-3]，其使用囊胚腔擴(kuò)張程度、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)外觀和滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞(TE)的外觀來(lái)評(píng)價(jià)囊胚質(zhì)量。

隨著胚胎植入前非整倍體檢測(cè)(Preimplantation genetic testing for aneuploidy，PGT-A)的開展，囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分與胚胎整倍性的關(guān)系越來(lái)越受到關(guān)注。一些研究將囊胚形態(tài)學(xué)的整體評(píng)級(jí)作為獨(dú)立指標(biāo)，研究其與胚胎整倍性的關(guān)系[4-5]，還有研究分別將ICM分級(jí)、TE分級(jí)和囊胚腔的擴(kuò)張程度作為3個(gè)獨(dú)立指標(biāo)探討其與胚胎整倍性的關(guān)系[6-7]。此外，囊胚發(fā)育天數(shù)與擴(kuò)張程度共同體現(xiàn)了囊胚的發(fā)育速度，有些學(xué)者認(rèn)為囊胚腔擴(kuò)張程度變化快，不可作為可靠的評(píng)價(jià)指標(biāo)[8]；而另一些學(xué)者認(rèn)為，囊胚發(fā)育速度是其整倍體率的獨(dú)立影響因素[9]。因此，如何選擇囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)探討形態(tài)學(xué)評(píng)分與胚胎整倍性的關(guān)系仍然存在爭(zhēng)議。

女性卵母細(xì)胞整倍體率和活產(chǎn)率隨年齡的增長(zhǎng)而下降[6，10-11]。有研究提示在PGT-A周期中，整倍體胚胎的形態(tài)學(xué)評(píng)分可預(yù)測(cè)繼續(xù)妊娠率[12-13]，且胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分越高其移植后活產(chǎn)率越高[3，14-19]。也有研究表明，胚胎整倍性與活產(chǎn)密切相關(guān)，超過50%的整倍體胚胎可獲得活產(chǎn)，且這一結(jié)論與女方年齡和囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分無(wú)關(guān)[4-5，20-22]。由于胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分、胚胎整倍性和臨床妊娠結(jié)局之間的關(guān)系仍存在爭(zhēng)議，如何最大限度的提高患者收益、縮短獲得妊娠的時(shí)間是生殖領(lǐng)域醫(yī)生面對(duì)的挑戰(zhàn)。本研究回顧性分析在本中心進(jìn)行活檢的囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分和相關(guān)臨床資料，探討囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分在PGT-A周期中的指導(dǎo)作用。

資料和方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2019年1～12月在本中心行PGT-A的177個(gè)取卵周期(共732枚活檢胚胎)的臨床資料。本中心進(jìn)行PGT-A的適應(yīng)癥(符合其一即可)：(1)不明原因反復(fù)妊娠丟失(RPL≥2次)；(2)高齡(年齡≥38歲)；(3)流產(chǎn)物檢測(cè)出染色體非整倍體；(4)反復(fù)移植失敗(RIF)；(5)夫妻一方為染色體數(shù)目異常。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者卵巢刺激均使用激動(dòng)劑降調(diào)節(jié)方案(卵泡期長(zhǎng)方案或黃體期長(zhǎng)方案)或拮抗劑方案；(2)所有胚胎都在囊胚期進(jìn)行活檢；(3)均采用二代測(cè)序(NGS)進(jìn)行非整倍體篩查檢測(cè)；(4)所有卵母細(xì)胞均來(lái)自患者本人，無(wú)供卵周期。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)因活檢細(xì)胞量不足或單細(xì)胞擴(kuò)增失敗導(dǎo)致檢測(cè)失敗的胚胎；(2)因高齡、RPL行PGT-A的胚胎；(3)重復(fù)活檢的胚胎；(4)嵌合體胚胎；(5)因夫妻一方染色體異常導(dǎo)致的非整倍體胚胎；(6)臨床數(shù)據(jù)不全(如缺失年齡或隨訪結(jié)果)的胚胎。

按照納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，最終本研究共納入474枚囊胚，其中因流產(chǎn)物檢測(cè)出染色體非整倍體行PGT-A的胚胎占比51.9%(246/474)，因RIF行PGT-A的胚胎占比1.1%(5/474)，因夫妻一方染色體數(shù)目異常行PGT-A的胚胎占比47.0%(223/474)。

二、診療回顧

具有PGT-A適應(yīng)癥的患者通過控制性促排卵后接受取卵手術(shù)，使用卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)技術(shù)進(jìn)行體外受精，之后在體外培養(yǎng)至第5天(D5)或D6形成囊胚，利用激光法進(jìn)行囊胚活檢，隨后進(jìn)行NGS檢測(cè)。

1.控制性促排卵：激動(dòng)劑方案使用曲普瑞林(Triptorelin，輝凌公司，瑞士)進(jìn)行降調(diào)節(jié)；拮抗劑方案使用醋酸西曲瑞克(Cetrorelix Aacetate Ppowder，百特腫瘤制藥有限公司，德國(guó))抑制LH峰。予以重組人卵泡刺激素(rFSH，默克雪蘭諾公司，瑞士)和/或人尿促性素(HMG，珠海麗珠制藥公司)進(jìn)行卵巢刺激。B超監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育，當(dāng)超聲監(jiān)測(cè)有2個(gè)以上優(yōu)勢(shì)卵泡直徑≥18 mm時(shí)，予人絨毛膜促性腺激素(HCG，沈陽(yáng)光大制藥有限公司)肌內(nèi)注射10 000 U，36～38 h后超聲引導(dǎo)下卵泡穿刺取卵。

2.體外受精與活檢：所有卵母細(xì)胞均行ICSI。胚胎培養(yǎng)采用G系列序貫培養(yǎng)系統(tǒng)。受精后5～6 d，對(duì)質(zhì)量?jī)?yōu)于3BC的囊胚進(jìn)行活檢。利用激光法于囊胚ICM對(duì)側(cè)的滋養(yǎng)外胚層分離出3～8個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。冷凍活檢后的囊胚，等待檢測(cè)結(jié)果。

3.囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分：本中心采用Gardner提出的囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分方法[1-3]進(jìn)行評(píng)價(jià)，囊胚腔擴(kuò)張程度3期以上、ICM和TE總體評(píng)分在AA/AB/BA的為優(yōu)質(zhì)囊胚，BB為一般囊胚，余下等級(jí)為較差囊胚[8]。評(píng)級(jí)低于3BC囊胚丟棄，不予活檢。

4.PGT-A檢測(cè)：文庫(kù)制備使用植入前遺傳學(xué)篩查試劑盒(Pre-implantation Genetics Screening Library Prep Kit，億康基因，中國(guó))進(jìn)行。用基于多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)的基因擴(kuò)增和文庫(kù)構(gòu)建法(MALBAC-Lab)進(jìn)行全基因組擴(kuò)增和文庫(kù)構(gòu)建。測(cè)序平臺(tái)為MiniSeq，測(cè)序結(jié)果由億康基因公司行質(zhì)量控制。

5.冷凍囊胚復(fù)蘇移植：均采用激素替代周期進(jìn)行內(nèi)膜準(zhǔn)備，行凍融單囊胚移植。囊胚復(fù)蘇使用玻璃化解凍試劑盒(Kitazato Biopharma Co.Ltd，日本)。

6.隨訪：移植后14 d測(cè)血HCG，陽(yáng)性者移植后28 d行B超檢查，見宮內(nèi)孕囊及胎心搏動(dòng)者確定為臨床妊娠。所有臨床妊娠患者隨訪至妊娠終止或活產(chǎn)。

三、研究分組

本研究按照兩個(gè)層次進(jìn)行分析比較。首先對(duì)在本中心行PGT-A的所有732枚囊胚按照納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，共有474枚囊胚納入研究，按照活檢時(shí)間不同分為D5組(204枚)和D6組(270枚)(具體篩選及胚胎評(píng)分情況見圖1)，探討囊胚評(píng)

圖1 所有活檢囊胚的篩選流程

級(jí)與整倍體率及活產(chǎn)率的關(guān)系?？紤]到本研究中大部分囊胚ICM和TE評(píng)分為BB級(jí)，故將納入研究的244枚BB級(jí)囊胚按照不同囊胚擴(kuò)張程度分為<4期、4期和>4期3組(具體篩選及胚胎評(píng)分情況見圖2)，探討D5或D6活檢的囊胚擴(kuò)張程度對(duì)整倍體率和活產(chǎn)率的影響。

圖2 BB級(jí)活檢囊胚的篩選流程

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 9統(tǒng)計(jì)軟件系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料的組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)或ANOVA分析，組間率的比較采用Chi-square檢驗(yàn)，不滿足Chi-square檢驗(yàn)的采用Fisher確切概率法檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、納入囊胚的患者基線資料比較

474枚囊胚中D5活檢囊胚204枚，其中優(yōu)質(zhì)囊胚19枚，一般囊胚129枚，較差囊胚56枚；D6活檢囊胚270枚，其中優(yōu)質(zhì)囊胚10枚，一般囊胚115枚，較差囊胚145枚。各亞組間女方平均年齡、基礎(chǔ)FSH、抗苗勒管激素(AMH)、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)值比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

表1 納入囊胚不同活檢時(shí)間和評(píng)級(jí)亞組的基線資料比較(-±s)

通過PGT-A獲得的233枚整倍體胚胎中，移植了126枚，根據(jù)移植的囊胚不同分為D5移植組(移植D5活檢囊胚，n=61)和D6移植組(移植D6活檢囊胚，n=65)。D5移植組中移植優(yōu)質(zhì)囊胚8枚，一般囊胚40枚，較差囊胚13枚；D6移植組中移植優(yōu)質(zhì)囊胚5枚，一般囊胚32枚，較差囊胚28枚。各亞組間女方平均年齡、基礎(chǔ)FSH、AMH、BMI值比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

表2 移植不同時(shí)間整倍體囊胚各亞組基線資料比較(-±s)

二、納入囊胚各組整倍體率和移植臨床結(jié)局比較

D5組活檢囊胚的整倍體率比較，一般囊胚顯著高于較差囊胚(P=0.025，OR=2.173，95%CI：1.160-4.043)，其余各組比較整倍體率均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。D6組活檢囊胚的整倍體率比較，一般囊胚亦顯著高于較差囊胚(P=0.005，OR=2.094，95%CI：1.280-3.488)，其余各組比較整倍體率均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。D5組和D6組兩組間優(yōu)質(zhì)囊胚、一般囊胚、較差囊胚的整倍體率比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表3)。

PGT-A檢測(cè)后獲得的整倍體囊胚中，移植D5優(yōu)質(zhì)囊胚、一般囊胚、較差囊胚的活產(chǎn)率無(wú)顯著性差異(P>0.05)；移植D6優(yōu)質(zhì)囊胚、一般囊胚、較差囊胚的活產(chǎn)率無(wú)顯著性差異(P>0.05)。兩組間比較，移植D5、D6不同囊胚評(píng)級(jí)的活產(chǎn)率亦無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 納入囊胚各亞組整倍體率和活產(chǎn)率比較(%)

三、BB級(jí)囊胚各組患者基線資料比較

244枚BB級(jí)囊胚中D5活檢囊胚(D5組)129枚，其中擴(kuò)張程度<4期囊胚35枚，4期囊胚92枚，>4期囊胚2枚；D6活檢囊胚(D6組)115枚，擴(kuò)張程度<4期囊胚12枚，4期囊胚82枚，>4期囊胚21枚。各亞組間女方平均年齡、基礎(chǔ)FSH、AMH、BMI值比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表4)。通過PGT-A獲得的整倍體胚胎中，移植了72枚，其中D5移植組40枚(擴(kuò)張程度<4期的9枚，4期的31枚，>4期的0枚)；D6移植組32枚(擴(kuò)張程度<4期的2枚，4期的22枚，>4期的8枚)。各亞組間女方平均年齡、基礎(chǔ)FSH、AMH、BMI值比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表5)。

表4 BB級(jí)囊胚不同活檢時(shí)間和擴(kuò)張程度亞組的基線資料比較(-±s)

表5 移植不同時(shí)間BB級(jí)整倍體囊胚各亞組基線資料比較(-±s)

四、BB級(jí)囊胚各組整倍體率和移植臨床結(jié)局比較

BB級(jí)囊胚中D5組活檢囊胚的整倍體率比較，擴(kuò)張程度<4期、4期、>4期各組整倍體率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；D6組活檢囊胚的整倍體率比較，擴(kuò)張程度<4期組顯著高于4期組(P=0.026，OR=0.203，95%CI：0.057-0.711)，余各組囊胚整倍體率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。D5組和D6組兩組間擴(kuò)張程度<4期、4期、>4期組的整倍體率比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表6)。

PGT-A檢測(cè)后獲得的BB級(jí)整倍體囊胚中，移植D5擴(kuò)張程度<4期、4期、>4期囊胚的活產(chǎn)率無(wú)顯著性差異(P>0.05)；移植D6擴(kuò)張程度<4期、4期、>4期囊胚的活產(chǎn)率無(wú)顯著性差異(P>0.05)。兩組間比較，移植D5、D6不同擴(kuò)張程度的囊胚活產(chǎn)率亦無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表6)。

表6 BB級(jí)活檢囊胚各亞組整倍體率和活產(chǎn)率比較(%)

討 論

隨著NGS技術(shù)的發(fā)展，PGT-A技術(shù)被臨床廣泛運(yùn)用。但是，其有效性和安全性尚存在爭(zhēng)議。為了更好地提高患者的囊胚利用率、節(jié)省患者的治療費(fèi)用、縮短其獲得妊娠的時(shí)間，移植囊胚的選擇就顯得尤為重要。已有研究表明，囊胚形態(tài)學(xué)與整倍體率相關(guān)[4-7，23]，其整倍體率主要受促排卵方案和培養(yǎng)體系影響，與囊胚培養(yǎng)天數(shù)無(wú)關(guān)[24]。而另一些研究發(fā)現(xiàn)，D5活檢的囊胚其整倍體率和活產(chǎn)率顯著高于D6活檢的囊胚[25-26]。國(guó)內(nèi)研究證明，無(wú)論是新鮮周期還是凍融周期的單囊胚移植，囊胚擴(kuò)張程度可預(yù)測(cè)活產(chǎn)，而ICM及TE分級(jí)則與活產(chǎn)無(wú)關(guān)[27]。也有文獻(xiàn)指出擴(kuò)張程度4期以上的囊胚有較高的著床率[28]。但基于現(xiàn)有研究結(jié)果，囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分、胚胎整倍體率和臨床結(jié)局之間的關(guān)系仍然存在爭(zhēng)議。

本研究納入的研究對(duì)象均為凍融移植周期單囊胚移植患者，且內(nèi)膜準(zhǔn)備方案均為激素替代周期，以排除不同的卵巢刺激方案對(duì)內(nèi)膜容受性的影響以及移植胚胎數(shù)目對(duì)臨床結(jié)局的影響，同時(shí)還排除了高齡、染色體異常、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、RIF等因素，以盡量減少臨床結(jié)局的混雜因素。本研究將ICM、TE評(píng)分以及囊胚擴(kuò)張程度作為獨(dú)立因素分別討論，評(píng)價(jià)囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分在PGT-A周期中的指導(dǎo)作用。本研究結(jié)果顯示，整體納入研究的囊胚中ICM和TE評(píng)分較差囊胚的非整倍體率顯著升高，而囊胚發(fā)育天數(shù)對(duì)其整倍體率并無(wú)顯著預(yù)測(cè)作用。對(duì)于同級(jí)別的整倍體胚胎，雖然最終結(jié)果沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但發(fā)育速度快的(D5活檢)囊胚其活產(chǎn)率略高于發(fā)育較慢胚胎(D6活檢)，原因可能是D6囊胚較D5囊胚發(fā)育速度延遲，且體外培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，DNA損傷的可能性增加，導(dǎo)致發(fā)育潛能較差[29]。凍融周期中D5囊胚在玻璃化冷凍及復(fù)蘇過程中，可能更能耐受冷凍損傷，有較高的發(fā)育潛能[30]。BB級(jí)囊胚統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示D6活檢評(píng)級(jí)為BB級(jí)的囊胚擴(kuò)張程度<4期時(shí)，其非整倍體率較4期組更高。雖然D5活檢的整倍體胚胎移植活產(chǎn)率有高于D6的趨勢(shì)，但差異尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，我們認(rèn)為，PGT-A可優(yōu)先用于檢測(cè)發(fā)育速度較慢(D6囊胚)、擴(kuò)張程度<4期的較差囊胚(ICM和TE評(píng)級(jí)低于BB級(jí))。在移植時(shí)，囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分與臨床結(jié)局無(wú)關(guān)，建議優(yōu)先選擇發(fā)育速度較快(D5活檢)的整倍體胚胎進(jìn)行移植。但本研究也存在一定的局限性，首先，納入研究數(shù)目較少且納入的囊胚多為4BB級(jí)別，因此其分析結(jié)果可能存在一定偏倚，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量后進(jìn)行研究；其次，囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分具有一定主觀性，可能造成偏倚。

綜上所述，本研究結(jié)果再次證實(shí)了囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分越差，其非整倍體發(fā)生率越高。在通過PGT-A檢測(cè)后，D5活檢獲得的整倍體胚胎移植時(shí)具有更高的活產(chǎn)率。因此，建議臨床工作中，對(duì)于發(fā)育速度較慢(D6囊胚)、擴(kuò)張程度<4期的較差囊胚(ICM和TE評(píng)級(jí)低于BB級(jí))進(jìn)行PGT-A檢測(cè)更具臨床意義；經(jīng)PGT-A篩查獲得的整倍體胚胎，胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分在預(yù)測(cè)活產(chǎn)率中無(wú)明顯作用，建議優(yōu)先選擇發(fā)育速度較快(D5活檢)的整倍體胚胎進(jìn)行移植。