趙海靜，邱綺，歐陽能勇，朱玉琴，王文軍

(中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院生殖中心，廣州 510120)

人類輔助生殖的常規(guī)體外受精(IVF)過程中，正常受精的定義是受精后16～20 h內(nèi)觀察到受精卵中有兩個清晰的原核(2 pronucleus，2PN)及兩個極體(2 polar body，2pb)[1]。非正常形態(tài)學(xué)標準的受精卵，例如零原核(0PN)、單原核(1PN)、三個原核或多個原核(3PN或多PN)伴隨有或無第二極體，統(tǒng)稱為異常受精[2]。其中受精卵含有三個或三個以上原核稱為多精子受精，主要原因是受精時有兩個或兩個以上精子穿入卵母細胞。導(dǎo)致多條精子進入卵母細胞的原因有以下幾個方面：(1)卵母細胞不成熟或過熟；(2)精子濃度過高；(3)透明帶異常；(4)卵泡液中高孕酮水平；(5)血清中高雌激素水平。在常規(guī)IVF過程中，多精子受精的發(fā)生率可達2%～10%，被認為是導(dǎo)致早期胚胎死亡、流產(chǎn)和胎兒遺傳學(xué)疾病的主要原因[1]，也是導(dǎo)致IVF周期整體失敗的一個因素[3]。尤其是當(dāng)患者只獲得一個卵母細胞時，其受精結(jié)局更為重要，若為多精子受精，則無可利用胚胎，本次治療周期失敗，給患者造成一定的心理負擔(dān)和經(jīng)濟損失。

臨床上3PN或多PN胚胎已經(jīng)被確定為染色體異常，因此多精子受精直接否認了該胚胎的可利用性。作為多精子受精原因之一的“血清中高雌激素水平”給我們以啟發(fā)。本研究旨在分析常規(guī)IVF周期中，僅獲單一卵母細胞周期的正常受精與多精子受精者血清中各種激素水平之間的差異，探究對受精結(jié)局可能產(chǎn)生影響的激素及其濃度截斷值，為減少僅獲的單一卵母細胞發(fā)生多精子受精，增加胚胎移植及妊娠機會提供參考。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2015年1月至2019年12月在本中心行常規(guī)IVF助孕且僅獲得一個卵母細胞的患者臨床資料。

納入標準：(1)僅獲一個卵母細胞(單一卵母細胞)，且常規(guī)IVF助孕；(2)D1單一卵母細胞原核觀察為2PN受精；(3)D1單一卵母細胞原核觀察為3PN或多PN受精。

排除標準：(1)D1單一卵母細胞形態(tài)學(xué)觀察為MI、GV、退化或空透明帶；(2)D1單一卵母細胞原核觀察為0PN受精(MII或2pb)；(3)D1單一卵母細胞原核觀察為1PN受精。

本研究共納入433例患者，根據(jù)單一卵母細胞受精結(jié)局分為IVF-2PN組(n=326)和IVF-3PN組(n=107)。

二、研究方法

1.促排卵方案及取卵：入組患者所采用的控制性促排卵方案包括微刺激方案、輕微刺激方案、自然/半自然方案、黃體期促排卵方案、拮抗劑方案等多種用藥方案。陰道B 超監(jiān)測卵泡生長情況，當(dāng)B超監(jiān)測有1～2個卵泡直徑≥18 mm時肌肉注射HCG(珠海麗珠)10 000 U，36～37 h后取卵。

2.體外受精、原核觀察：獲卵后經(jīng)培養(yǎng)4～6 h行常規(guī)IVF，所有精液經(jīng)過優(yōu)化處理后，均調(diào)至統(tǒng)一的受精濃度0.3×106/ml。受精16～20 h后評估原核情況，受精卵中有一個雌原核和一個雄原核的歸于IVF-2PN組；受精卵中有3個或3個以上原核的歸于IVF-3PN組。

3.評價指標：記錄兩組患者年齡、不孕年限、助孕次數(shù)、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)激素水平(FSH、LH、E2、PRL)；促排卵中Gn總量，Gn日血清FSH、LH、E2水平，HCG總量，HCG日血清FSH、LH、E2水平。

4.激素濃度截斷值計算：通過受試者操作特征曲線(ROC curve)分別計算血清基礎(chǔ)E2、Gn日血清LH和E2、HCG日血清LH的濃度截斷值。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者基本資料

兩組患者間年齡、不孕年限、BMI、基礎(chǔ)FSH、基礎(chǔ)LH、基礎(chǔ)PRL水平均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；而IVF-3PN組的基礎(chǔ)E2水平顯著高于IVF-2PN組(P<0.01)(表1)。

表1 兩組患者基本資料比較(-±s)

二、兩組患者促排卵的情況

比較患者在控制性促排卵治療期間的主要信息，如Gn總量、Gn日血清FSH、LH、E2水平、HCG總量、HCG日血清FSH、LH、E2水平。結(jié)果顯示，與IVF-2PN組相比，IVF-3PN組Gn日血清LH和E2水平顯著升高(P<0.01)，HCG日血清LH水平顯著升高(P<0.05)，而Gn總量顯著降低(P<0.05)(表2)。

表2 兩組患者促排卵情況比較(-±s)

三、Gn總量、不同時間點血清LH和E2水平與單一卵母細胞多精子受精結(jié)局的相關(guān)性

以Gn總量、每種激素水平為自變量，以受精結(jié)局(2PN或3PN)為因變量，用Logistic 回歸模型分析單一卵母細胞發(fā)生多精子受精的危險因素。結(jié)果顯示，基礎(chǔ)E2水平、Gn總量、Gn日血清LH和E2水平、HCG日血清LH水平與單一卵母細胞多精子受精均存在顯著相關(guān)性(P<0.05)(表3)。

表3 單一卵母細胞多精子受精的相關(guān)因素Logistic回歸分析

四、不同時間點血清LH和E2濃度的截斷值

以各種激素水平為自變量，單一卵母細胞受精結(jié)局(2PN或3PN)為因變量，通過ROC曲線來判斷各個激素濃度截斷值。分析結(jié)果表明：血清基礎(chǔ)E2濃度截斷值為258.74 pmol/L[AUC=0.533，95%CI(0.482，0.583)，P=0.200]；Gn日血清LH濃度截斷值為6.32 U/L[AUC=0.583，95%CI(0.534，0.632)，P=0.001]、E2濃度截斷值為471.60 pmol/L[AUC=0.575，95%CI(0.526，0.624)，P=0.003]；HCG日血清LH濃度截斷值為3.28 U/L[AUC=0.591，95%CI(0.542，0.639)，P=0.000](圖1)。

A：基礎(chǔ)血清E2濃度；B：Gn日血清LH濃度；C：Gn日血清E2濃度；D：HCG日血清LH濃度圖1 不同時間點血清激素水平預(yù)測單一卵母細胞多精子受精的ROC曲線

將以上各個激素水平聯(lián)合起來作為多因素進行ROC曲線分析，結(jié)果為[AUC=0.631，95%CI(0.569，0.693)，P=0.000](圖2)，AUC面積增加且P<0.05，說明各激素濃度聯(lián)合起來的預(yù)測效果較好。

圖2 不同時間點血清激素水平聯(lián)合預(yù)測單一卵母細胞多精子受精的ROC曲線

五、患者不同時間點血清LH和E2濃度對其單一卵母細胞受精結(jié)局的影響

根據(jù)前面計算的不同時間點血清LH和E2截斷值，將患者進行亞分組：激素低濃度組(<截斷值)和激素高濃度組(≥截斷值)。比較不同亞組間的IVF-2PN及IVF-3PN比例。結(jié)果顯示，不同激素高濃度組中的IVF-2PN比例均顯著低于激素低濃度組(P<0.05)，而IVF-3PN比例均顯著高于激素低濃度組(P<0.05)(表4)。

表4 激素低濃度組與激素高濃度組中IVF-2PN和IVF-3PN的比例[n(%)]

討 論

多精子受精對胚胎發(fā)育是災(zāi)難性的傷害[4]。目前研究表明，卵母細胞質(zhì)量、透明帶(zona pellucida，ZP)分子結(jié)構(gòu)改變、皮質(zhì)反應(yīng)改變、HCG日血清高E2水平、卵泡液中高孕酮水平等因素影響多精子受精的發(fā)生[5-9]。卵母細胞質(zhì)量的主要影響因素包括女方年齡、促排卵方案及卵泡大小。前期研究中我們將女方年齡、促排卵方案分別與單一卵母細胞受精結(jié)局進行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示：女方年齡(P=0.546)及促排卵方案(P=0.214)與單一卵母細胞的受精結(jié)局均無顯著相關(guān)性(P>0.05)。本研究收集的病例，取卵時卵泡直徑均≥18 mm，說明卵母細胞的成熟程度較好。有文獻報道，卵母細胞ZP厚度及其完整性與血清雌激素水平有關(guān)，而ZP質(zhì)量與精子穿透密切相關(guān)，如果ZP質(zhì)量受到破壞，會使多精子受精的發(fā)生率增加[9]。Loret De Mola等[10]指出，血清高雌激素水平會減少ZP中一種糖原(PAS)染色陽性的物質(zhì)，從而引起ZP結(jié)構(gòu)改變。依據(jù)我們的研究結(jié)果推測，基礎(chǔ)血清E2水平和Gn日血清E2水平的顯著提高使單一卵母細胞ZP結(jié)構(gòu)異常，導(dǎo)致多精子受精的發(fā)生。磷脂酰肌醇信號通路在皮質(zhì)反應(yīng)中起著重要作用，該通路的改變可能會破壞膜阻斷，導(dǎo)致多精子受精發(fā)生[11]。張穎等[9]的研究結(jié)論是HCG日較高E2水平與3PN發(fā)生有關(guān)，而我們的結(jié)果是IVF-3PN組HCG日血清LH水平顯著提高，但兩者并不矛盾，因為LH可作用于卵泡內(nèi)膜細胞上的LH受體，促進內(nèi)膜細胞利用膽固醇合成和分泌雄激素。分泌出的雄激素經(jīng)過擴散進入顆粒細胞后，會被顆粒細胞中的芳香化酶轉(zhuǎn)化成E2[12]，說明HCG日血清高LH水平間接意味著血清高E2水平。有文獻報道Gn用量偏小的周期中更易發(fā)生多精子受精[13]，本研究中IVF-3PN組Gn總量顯著低于IVF-2PN組(P<0.05)，支持這一結(jié)論。

除了卵母細胞相關(guān)因素外，多精子受精還與精子濃度有關(guān)[14]，精子濃度過高導(dǎo)致多精子受精頻率增加，但是降低精子濃度則造成精子穿透率減少。然而Uhler等[15]的研究中使用不同濃度的前向運動精子進行比較，發(fā)現(xiàn)精子濃度增加并未增加多精子受精的發(fā)生風(fēng)險。本研究中，單一卵母細胞體外受精時均調(diào)至統(tǒng)一的授精濃度0.3×106/ml，因此多精子受精的發(fā)生與精子濃度的關(guān)聯(lián)不大。

本研究中，IVF-3PN組患者的基礎(chǔ)E2水平、Gn日血清LH、E2水平和HCG日血清LH水平均顯著高于IVF-2PN組(P<0.05)，提示這些激素可能與單一卵母細胞多精子受精有關(guān)。對以上各時間點激素水平進行Logistic回歸分析，結(jié)果提示它們與單一卵母細胞多精子受精之間均存在顯著相關(guān)性(P<0.05)。通過ROC曲線計算出各激素濃度截斷值并根據(jù)截斷值進行亞分組分析，在不同時間點的各個激素中，激素高濃度組的IVF-2PN比例均顯著低于激素低濃度組(P<0.05)，而IVF-3PN比例均顯著高于激素低濃度組(P<0.05)，表明當(dāng)血清基礎(chǔ)E2水平、Gn日血清LH、E2水平和HCG日血清LH水平分別高于對應(yīng)的濃度截斷值時，可能會增加單一卵母細胞發(fā)生多精子受精的風(fēng)險，但相應(yīng)的分子機制需要進一步的探索驗證。

本研究從“血清激素水平”這一角度，探究了在常規(guī)IVF周期中，患者血清中LH和E2水平與其單一卵母細胞受精結(jié)局之間的可能相關(guān)性。血清激素水平對單一卵母細胞多精子受精的預(yù)測價值需要綜合考慮LH和E2兩種激素濃度的動態(tài)變化。而ZP分子結(jié)構(gòu)的改變、卵泡液中孕酮水平的差異將在后續(xù)的前瞻性研究中繼續(xù)探討。