李 靜，黃婭芬，夏曉楓，唐家國(guó)

(1.湖北省武漢市第三醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430000 2.長(zhǎng)江航運(yùn)總醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430010)

腰椎間盤退變是引起腰椎疾病及腰腿痛的重要原因，據(jù)世界流行病學(xué)分析，我國(guó)每年罹患腰椎疾病的患者約達(dá)800～1000萬(wàn)人，嚴(yán)重影響我國(guó)國(guó)民的生活質(zhì)量[1]。腰椎間盤退變機(jī)制及病理因素復(fù)雜，一直是骨科研究的重點(diǎn)[2]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)髓核細(xì)胞衰老、凋亡、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等病理因素是導(dǎo)致腰椎間盤退變的主要原因[3]。但引起髓核細(xì)胞凋亡的分子生物學(xué)機(jī)制，還不甚明確。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)信號(hào)通路可調(diào)控細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等生理活動(dòng)來(lái)參與疾病的發(fā)展過(guò)程[4]，Nrf2入核后可激活抗氧化、抗炎途徑，對(duì)髓核細(xì)胞炎癥損傷及凋亡具有保護(hù)作用，逐漸受到骨科學(xué)者研究的重視[5]。另外，尋找抑制髓核細(xì)胞凋亡的有效藥物，對(duì)治療腰椎間盤退變，緩解患者腰椎疼痛有一定的臨床意義。銀杏總黃酮(total flavonoids of Ginkgo biloba，TFG)為銀杏葉提取物中的重要活性成分之一，具有抗氧化、抗炎、抗細(xì)胞凋亡等多種藥理作用，且對(duì)阿爾茨海默癥等神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病的神經(jīng)損傷及神經(jīng)凋亡有一定改善作用[6]。但TFG對(duì)髓核細(xì)胞凋亡的影響還未見報(bào)道，本研究通過(guò)體外白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)誘導(dǎo)建立髓核細(xì)胞凋亡模型，探究TFG對(duì)髓核細(xì)胞凋亡及Nrf2/ARE通路的影響，以期為TFG的開發(fā)應(yīng)用及腰椎間盤退變的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1細(xì)胞來(lái)源:人椎間盤髓核細(xì)胞(上海梵態(tài)生物科技有限公司，批號(hào)：FT-LY0104)。

1.1.2主要藥物、試劑與儀器:TFG(北京儀化通標(biāo)科技有限公司，原料藥，純度99%，批號(hào)：PRF00159)；DMEM培養(yǎng)基、IL-1β溶液(北京凱瑞基生物科技有限公司，批號(hào)：120026、140057)；CCK-8試劑盒(武漢科昊佳生物科技有限公司，批號(hào)：CK04-500T)；Nrf2通路抑制劑(Brusatol)(美國(guó)MCE公司，批號(hào)：HY-19742)；hochest 33258染色試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：KGA211)；活性氧熒光探針(DCFH-DA)(上海懋康生物科技有限公司，批號(hào)：MX4803-10)；Nrf2、ARE、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved caspase-3)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、血紅素加氧酶1(HO-1)、GAPDH單克隆抗體、羊抗人二抗(美國(guó)abcam公司，批號(hào)：ab2302、ab89443、ab255275、ab189491、ab89119、ab10003、ab10117)；化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒(上海士鋒生物科技有限公司，批號(hào)：R1686)；酶標(biāo)儀(深圳市恩科生物科技有限公司，型號(hào)：Sunrise)；熒光顯微鏡(南京貝登醫(yī)療股份有限公司，型號(hào)：CX43)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(北京原平皓生物技術(shù)有限公司，型號(hào)：Tanon 5200)。

1.2方 法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng):取椎間盤髓核細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后，用含20%胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基于恒溫培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)中培養(yǎng)，并用胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。

1.2.2CCK-8法檢測(cè)不同濃度TFG對(duì)椎間盤髓核細(xì)胞增殖活性的影響:取椎間盤髓核細(xì)胞分為正常組、IL-1β誘導(dǎo)組、二甲基亞砜(DMSO)組、TFG不同濃度組(5、10、20、40、80、160mg/mL)組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔(1×105個(gè)/孔)。正常組常規(guī)培養(yǎng)不做任何處理；IL-1β誘導(dǎo)組參照文獻(xiàn)[7]加入濃度為10ng/mL的IL-1β溶液誘導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡；DMSO組加入濃度為10ng/mL的IL-1β溶液和0.1% DMSO溶液作為陰性對(duì)照；TFG不同濃度組加入濃度為10ng/mL的IL-1β溶液以及參照文獻(xiàn)[8]設(shè)置劑量并加入濃度為5、10、20、40、80、160mg/mL的TFG溶液(TFG預(yù)先用0.1%的DMSO溶解)進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)。各組均培養(yǎng)24h后取細(xì)胞，按CCK-8試劑盒說(shuō)明書方法，加入CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)2h后，用酶標(biāo)儀讀出各組細(xì)胞的OD值(450nm波長(zhǎng))，另取空白培養(yǎng)基進(jìn)行OD檢測(cè)作為空白OD值，根據(jù)公式細(xì)胞存活率(%)=[(試驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)]×100%，計(jì)算細(xì)胞存活率，存活率越大預(yù)示細(xì)胞增殖活性越高，并篩選出適宜的TFG濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3細(xì)胞分組處理:將椎間盤髓核細(xì)胞分為正常對(duì)照組、IL-1β誘導(dǎo)組、TFG低(20mg/mL)、高(80mg/mL)劑量組、Nrf2通路抑制劑組(Brusatol組，0.2μg/mL)、TFG+Brusatol組(80mg/mL+0.2μg/mL)，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔(1×105個(gè)/孔)。正常對(duì)照組不做任何處理，正常培養(yǎng)；除正常對(duì)照組外，其余各組均加入濃度為10ng/mL的IL-1β溶液誘導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡[7]，TFG低、高劑量組加入濃度為20mg/mL、80mg/mL的TFG溶液；Brusatol組參照文獻(xiàn)[9]加入濃度為0.2μg/mL的Nrf2通路抑制劑(Brusatol)溶液；TFG+Brusatol組加入濃度為0.2μg/mL的Brusatol及80mg/mL的TFG溶液干預(yù)培養(yǎng)。各組均培養(yǎng)24h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性:取1.2.3項(xiàng)中處理后的各組細(xì)胞，按1.2.2項(xiàng)中CCK-8法操作方法檢測(cè)髓核細(xì)胞增殖活性。

1.2.5hochest 33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況:取1.2.3項(xiàng)中處理后的各組細(xì)胞，按hochest 33258染色試劑盒說(shuō)明書方法對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行染色后，置于熒光顯微鏡下觀察，各組隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)目(細(xì)胞核染色為亮藍(lán)色的細(xì)胞)及細(xì)胞總數(shù)目(細(xì)胞核染色為亮藍(lán)色的細(xì)胞數(shù)目+細(xì)胞核染色為均勻淡藍(lán)色的細(xì)胞數(shù)目)，并計(jì)算細(xì)胞調(diào)亡率(細(xì)胞調(diào)亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)目/細(xì)胞總數(shù)目×100%)。

1.2.6免疫熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞中活性氧(ROS)含量:取1.2.3項(xiàng)中處理后的各組細(xì)胞，加入DCFH-DA探針并于室溫下孵育20min后，置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況，并隨機(jī)取5個(gè)視野，用Image Pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)單位面積內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度強(qiáng)弱，以單位面積內(nèi)熒光強(qiáng)度代表細(xì)胞中ROS相對(duì)含量。

1.2.7免疫熒光共聚焦法檢測(cè)Nrf2入核情況:取1.2.3項(xiàng)中處理后的各組細(xì)胞，加入濃度為20μmoL/L的特丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)處理45min、丙酮固定10min、0.25%曲拉通(TritonX-100)室溫透化6min、用含1%牛蛋白血清室溫封閉1h后，加入Nrf2特異性一抗(1：200)低溫(4℃)孵育過(guò)夜，再用Aexa Fluor488熒光標(biāo)記的二抗室溫孵育1h后，用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)避光染核3min，用防猝滅液封片后于激光共聚焦顯微鏡下觀察，拍照。

1.2.8蛋白免疫印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞Nrf2、ARE、cleaved caspase-3、TNF-α、HO-1蛋白表達(dá)水平:取1.2.3項(xiàng)中處理后的各組細(xì)胞，用胰蛋白酶消化、蛋白裂解液4℃裂解25min后3000r/min離心15min取上清液提取總蛋白，并用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取25μg蛋白樣品行上樣、跑膠、轉(zhuǎn)膜與電轉(zhuǎn)反應(yīng)、封閉后，加入一抗(Nrf2、ARE、cleaved caspase-3、TNF-α、HO-1、GAPDH抗體，稀釋倍數(shù)均為1∶1500，內(nèi)參抗體GAPDH稀釋倍數(shù)為1∶3000)，于4℃冰箱內(nèi)孵育過(guò)夜，加入二抗(稀釋4500倍的辣根過(guò)氧化物HRP)室溫下孵育1.5h。用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影后在化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)下拍照并分析灰度值。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度TFG對(duì)椎間盤髓核細(xì)胞增殖活性的影響:與正常組比較，IL-1β誘導(dǎo)組、DMSO組細(xì)胞增殖活性降低(P<0.05)。與IL-1β誘導(dǎo)組比較，隨著TFG濃度升高，細(xì)胞增殖活性逐漸升高，在80～160mg/mL時(shí)保持在穩(wěn)定水平，其中20、40、80、160mg/mL TFG組細(xì)胞增殖活性與IL-1β誘導(dǎo)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。DMSO組與IL-1β誘導(dǎo)組比較、80mg/mL TFG組與160mg/mL TFG組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，選用20mg/mL、80mg/mL為TFG低、高劑量組進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。見圖1。

圖1 各組髓核細(xì)胞存活率比較

2.2TFG對(duì)椎間盤髓核細(xì)胞增殖活性的影響:與正常對(duì)照組比較，IL-1β誘導(dǎo)組細(xì)胞增殖活性降低(P<0.05)。與IL-1β誘導(dǎo)組比較，TFG低、高劑量組細(xì)胞增殖活性升高(P<0.05)，且TFG高劑量組高于TFG低劑量組；Brusatol組細(xì)胞增殖活性降低(P<0.05)。與TFG高劑量組比較，TFG+Brusatol組細(xì)胞增殖活性降低(P<0.05)。見表1。

表1 TFG處理后各組細(xì)胞增殖活性比較

2.3TFG對(duì)椎間盤髓核細(xì)胞凋亡率的影響:hochest 33258染色顯示，凋亡細(xì)胞核染色為亮藍(lán)色熒光，正常細(xì)胞核染色為均勻淡藍(lán)色熒光。與正常對(duì)照組比較，IL-1β誘導(dǎo)組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。與IL-1β誘導(dǎo)組比較，TFG低、高劑量組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)，且TFG高劑量組低于TFG低劑量組；Brusatol組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。與TFG高劑量組比較，TFG+Brusatol組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 各組細(xì)胞hochest 33258染色圖(×400)

2.4TFG對(duì)椎間盤髓核細(xì)胞ROS含量的影響:與正常對(duì)照組比較，IL-1β誘導(dǎo)組ROS含量升高(P<0.05)。與IL-1β誘導(dǎo)組比較，TFG低、高劑量組ROS含量降低(P<0.05)，且TFG高劑量組低于TFG低劑量組；Brusatol組細(xì)胞ROS含量升高(P<0.05)。與TFG高劑量組比較，TFG+Brusatol組ROS含量升高(P<0.05)，見圖3，表3。

表2 各組細(xì)胞凋亡率比較

圖3 各組細(xì)胞ROS免疫熒光染色圖(×400)

表3 各組細(xì)胞ROS含量比較

2.5TFG對(duì)椎間盤髓核細(xì)胞Nrf2入核情況的影響:綠色熒光為Nrf2蛋白，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核。與正常對(duì)照組比較，IL-1β誘導(dǎo)組Nrf2入核數(shù)目升高(P<0.05)。與IL-1β誘導(dǎo)組比較，TFG低、高劑量組Nrf2入核數(shù)目升高(P<0.05)，且TFG高劑量組高于TFG低劑量組；Brusatol組Nrf2入核數(shù)目降低(P<0.05)。與TFG高劑量組比較，TFG+Brusatol組Nrf2入核數(shù)目降低(P<0.05)。見圖4，表4。

圖4 各組細(xì)胞Nrf2免疫熒光染色圖(×400)

表4 各組細(xì)胞Nrf2入核數(shù)目比較

2.6TFG對(duì)椎間盤髓核細(xì)胞Nrf2、ARE、cleaved caspase-3、HO-1、TNF-α蛋白表達(dá)的影響:與正常對(duì)照組比較，IL-1β誘導(dǎo)組Nrf2、ARE、cleaved caspase-3、HO-1、TNF-α蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。與IL-1β誘導(dǎo)組比較，TFG低、高劑量組Nrf2、ARE、HO-1蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，cleaved caspase-3、TNF-α蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，且TFG高劑量組Nrf2、ARE、HO-1蛋白表達(dá)水平高于TFG低劑量組(P<0.05)，cleaved caspase-3、TNF-α蛋白表達(dá)水平低于TFG低劑量組(P<0.05)；Brusatol組Nrf2、ARE、HO-1蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，cleaved caspase-3、TNF-α蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。與TFG高劑量組比較，TFG+Brusatol組Nrf2、ARE、HO-1蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，cleaved caspase-3、TNF-α蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。見圖5，表5。

表5 各組細(xì)胞Nrf2 ARE cleaved caspase-3 HO-1 TNF-α蛋白表達(dá)水平比較

圖5 各組細(xì)胞Nrf2、ARE、cleaved caspase-3、HO-1、TNF-α蛋白表達(dá)免疫印跡圖

3 討 論

椎間盤退變引起的腰椎疼痛給患者及社會(huì)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。髓核細(xì)胞過(guò)度凋亡在椎間盤退變過(guò)程中起關(guān)鍵作用。Chen[10]等研究發(fā)現(xiàn)，椎間盤退變過(guò)程中，多種因素如異常機(jī)械負(fù)荷、椎間盤細(xì)胞基質(zhì)合成與分解失衡等，會(huì)促進(jìn)炎性細(xì)胞因子水平如IL-1β和TNF-α分泌，引起髓核細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致椎間盤結(jié)構(gòu)和功能的改變，進(jìn)而加速椎間盤退變的病理過(guò)程，并認(rèn)為減少炎癥反應(yīng)，抑制髓核細(xì)胞凋亡，可能是治療椎間盤退變的有效策略。本研究用IL-1β體外誘導(dǎo)培養(yǎng)髓核細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)髓核細(xì)胞增殖活性降低，細(xì)胞凋亡率升高，并伴隨著凋亡蛋白cleaved caspase-3及炎癥因子TNF-α的顯著升高，提示IL-1β誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞凋亡模型造模成功。另外炎癥反應(yīng)又常伴隨著氧化應(yīng)激反應(yīng)，且研究證實(shí)髓核細(xì)胞是ROS的來(lái)源之一。Li等[11]發(fā)現(xiàn)過(guò)多的ROS是導(dǎo)致椎間盤退變患者髓核細(xì)胞基質(zhì)合成損傷及衰老凋亡的危險(xiǎn)因子之一。本研究也在髓核細(xì)胞凋亡過(guò)程中檢測(cè)到ROS含量的異常升高。

尋找抑制髓核細(xì)胞凋亡、炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)的藥物，對(duì)抑制椎間盤退變具有重要意義。TFG為銀杏葉中的活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗細(xì)胞凋亡等多種藥理作用。樊麗超等[8]發(fā)現(xiàn)TFG可抑制脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)及活化進(jìn)程，推測(cè)TFG可能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)，緩解神經(jīng)系統(tǒng)炎癥損傷。Arab-Nozari等[12]發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物中的TFG可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，保護(hù)肝臟細(xì)胞凋亡。但TFG是否對(duì)髓核細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用還未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著TFG濃度的升高，IL-1β刺激下的髓核細(xì)胞增殖活性逐漸升高，在80～160mg/mL時(shí)達(dá)到穩(wěn)定水平，且與IL-1β誘導(dǎo)組比較，TFG低、高劑量組髓核細(xì)胞增殖活性升高，并伴隨著凋亡率、凋亡蛋白cleaved caspase-3、炎癥因子TNF-α及氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS含量的降低，提示TFG也可抑制髓核細(xì)胞凋亡，其抑制作用可能與抑制髓核細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)有關(guān)。但其具體分子生物學(xué)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

Nrf2/ARE通路與機(jī)體抗氧化、抗應(yīng)激及抗凋亡關(guān)系密切，并越來(lái)越受到臨床疾病研究的重視。Jiang等[13]研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)或代謝產(chǎn)物ROS可刺激Nrf2與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Keap1)解聚，促進(jìn)Nrf2轉(zhuǎn)位入核與ARE結(jié)合，激活A(yù)RE下游抗氧化酶基因如HO-1的表達(dá)，進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞清除ROS能力并抑制巨噬細(xì)胞活性，發(fā)揮抗氧化、抗炎作用。常洪澤等[14]發(fā)現(xiàn)Nrf2/ARE通路可作為細(xì)胞重要的防御機(jī)制，參與髓核細(xì)胞炎癥、自噬及氧化應(yīng)激過(guò)程，并推測(cè)Nrf2/ARE通路有望成為防治椎間盤退變的新靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β誘導(dǎo)組髓核細(xì)胞凋亡過(guò)程中，Nrf2入核數(shù)目增多，ARE蛋白及其下游蛋白HO-1表達(dá)水平升高，而Nrf2/ARE通路抑制劑Brusatol可使得Nrf2入核數(shù)目減少，ARE及其下游HO-1蛋白表達(dá)減少，細(xì)胞增殖活性降低，凋亡率、cleaved caspase-3、TNF-α蛋白及ROS含量升高，提示炎癥刺激狀態(tài)可誘導(dǎo)Nrf2/ARE激活，抵抗炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞，但這種激活不足以抵抗炎癥及氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡，且抑制Nrf2/ARE激活可加重氧化應(yīng)激及炎癥損傷，加速髓核細(xì)胞凋亡。本研究采用TFG處理后，細(xì)胞Nrf2入核數(shù)目、ARE及其下游蛋白HO-1表達(dá)也顯著升高，細(xì)胞表現(xiàn)出更高的增殖活性及較低的凋亡水平，且上述作用可被Brusatol逆轉(zhuǎn)，提示TFG抑制髓核細(xì)胞凋亡作用可能與促進(jìn)Nrf2/ARE激活有關(guān)。

綜上所述，TFG可通過(guò)激活Nrf2/ARE通路，發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗髓核細(xì)胞凋亡作用，為闡明髓核細(xì)胞凋亡及腰椎間盤退變的分子生物學(xué)機(jī)制提供一定理論依據(jù)，但髓核細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制復(fù)雜，且途徑較多，TFG抑制髓核細(xì)胞凋亡的其他途徑還有待進(jìn)一步探究。