譚劍峰,李東方,郭權威,況 軍,張建華

(南方醫(yī)科大學深圳醫(yī)院胸外科,廣東 深圳 518000)

樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)是人體功能最強大的專職抗原提呈細胞(antigen presenting cell，APC)，在啟動、維持和調(diào)節(jié)免疫應答過程中處于中心環(huán)節(jié)，被認為是機體免疫的始動者。目前已知DC有兩個亞型，分別是漿細胞樣樹突狀細胞(plasmacytoid dendritic cells,pDC)和髓樣樹突狀細胞(myeloid dendritic cells,mDC)[1]。其中mDC具備典型的樹突狀形態(tài)，膜表面中高度表達MHC-Ⅱ類分子及Toll 樣受體(Toll like receptor,TLR)2、3、4、5、6、8，能移行至淋巴器官和刺激初始型T細胞增殖活化，參與機體免疫應答的啟動和調(diào)控，在抗腫瘤免疫反應中發(fā)揮重要作用[2]。而pDC則是一類近年來被認識并被證明在機體抵抗病毒感染以及在自身免疫性疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展方面發(fā)揮著重要調(diào)控作用的免疫細胞[3～5]。與mDC不同，pDC在形態(tài)上、分布上、TLR 受體表達上、表面標記上均有其鮮明的特征。功能上pDC由于特征性地表達單鏈病毒RNA 配體TLR 7 和DNA病毒及CpG 寡聚脫氧核苷酸(CpG ODN)的配體TLR 9，使其能夠與mDC形成互補，在病毒、CpG ODN 刺激下可以迅速分泌大量的Ⅰ型干擾素，發(fā)揮強大的抗感染等生物學效應[6]。關于mDC細胞亞群的體外培養(yǎng)及抗腫瘤生物學功能的研究已經(jīng)漸趨成熟，但有關pDC細胞亞群體外培養(yǎng)及抗腫瘤生物學功能研究較少，同時缺乏對pDC與mDC細胞亞群進行系統(tǒng)性對比研究。為探討小鼠骨髓樹突狀細胞亞群生物學功能的差異，我們對負載腫瘤細胞裂解物的小鼠骨髓漿細胞樣(pDC)與髓樣樹突狀細胞(mDC)亞群形態(tài)、免疫表型及細胞因子的分泌和促進淋巴細胞增殖等功能方面上進行對比實驗研究，為以DC細胞為基礎的生物免疫治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1動物與材料:C57BL/6雄性小鼠購自南方醫(yī)科大學動物中心。小鼠Lewis肺癌細胞購自ATCC細胞庫(美國)。非甲基化CpG基序的寡核苷酸(CpG ODN1826)，購自上海生工生物工程公司(中國)。IL-12 ELISA、TNF-α ELISA檢測試劑盒，購自BD公司(美國)。anti-CD11b分選磁珠及anti-mPDCA分選磁珠，購自Miltenyi Biotec公司(德國)。細胞計數(shù)試劑盒-8(cell conunting kit-8，CCK-8)，購自Dojido公司(日本)。重組小鼠fms樣酪氨酸激酶受體3配體(rmFlt3-Ligand)，anti-CD11c-PE mAb、anti-CD11b-APC mAb、anti-B220-FITC mAb、anti-MHC-II FITC mAb、anti-CD40 PE mAb、anti-CD80 PE mAb及anti-CD86 PE mAb，均購自eBioscience公司(美國)。

1.2實驗方法

1.2.1mDC與pDC的培養(yǎng)和分選：獲取C57BL/6小鼠的股骨骨髓細胞，經(jīng)紅細胞裂解液裂解后用RMPI-1640培養(yǎng)液(含rmFlt3-L 100ng/mL)重懸細胞，調(diào)節(jié)細胞濃度1×106/mL，并加入12孔板中培養(yǎng)，每4天時半換液，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至第15天，利用CCK-8法每2天檢測DC細胞的OD450值，然后利用流式細胞儀每4天檢測mDC及pDC的占比。后于培養(yǎng)的第8天利用磁珠分選出mDC及pDC，流式細胞儀檢測細胞純度大于99%，分選得到的mDC及pDC用于后續(xù)實驗。

1.2.2DC負載Lewis肺癌細胞裂解物與DC形態(tài)觀察：取對數(shù)期Lewis肺癌細胞，胰酶消化，用PBS洗滌2次，再用PBS按2×107/mL重懸Lewis肺癌細胞,然后在液氮及37℃中反復凍融3次，10000rmp 4℃離心15min，吸取上清液備用。分別往mDC(106)、pDC(106)兩組中加入等量的腫瘤細胞裂解液上清液(按DCs：腫瘤細胞=1∶1)，對照組則加入等量的培養(yǎng)液，然后加入終濃度為2μg/mL的CpG1826培養(yǎng)24h誘導DC細胞成熟，同時利用倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、數(shù)量、集落等生長情況。

1.2.3混合淋巴細胞增殖實驗:獲取小鼠脾臟，利用眼科剪將脾臟剪碎，置于70μm過濾網(wǎng)上，再用1mL注射器活栓尾部研磨，同時用PBS液沖洗，將收集到的脾臟細胞懸液放入離心管中，離心(1000rmp，6min)、棄上清。加入紅細胞裂解液裂解，待裂解結(jié)束后迅速加入培養(yǎng)液中止反應，再次離心(1000rpm，6min)，反復洗滌3次，棄上清即得脾臟細胞。將負載腫瘤細胞裂解物的mDC與pDC兩組細胞按105/孔加入64孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，然后加入脾臟細胞106/孔(按DCs：脾臟細胞=1∶10)，共培養(yǎng)3d，未負載腫瘤細胞裂解物的各組DC細胞作為對照組，共4組。同時設調(diào)零孔(培養(yǎng)液)，單獨的脾臟細胞培養(yǎng)孔(脾臟細胞及培養(yǎng)液)，每個組設3個復孔。用CCK-8法檢測混合淋巴細胞的增殖情況。采用酶標儀測定450nm波長吸光值(OD值)，以下述公式計算刺激指數(shù)SI，SI=(實驗組吸光度-調(diào)零孔吸光度)/(單獨的脾臟細胞培養(yǎng)孔-調(diào)零孔吸光度)。

1.2.4免疫表型及細胞因子的檢測：將實驗組和對照組細胞懸液分別標記anti-mouse CD80 PE-Cy7，anti-mouse CD86 APC，anti-mouse CD40 PE，anti-mouse MHC Class II FITC，anti-CD11c-PE mAb,anti-CD11b-APC mAb，anti-B220-FITC mAb熒光抗體，置4℃避光條件下孵育標記30min，同時以熒光標記的同型IgG作為對照；反復洗滌2次，1000rpm 20℃離心6min，棄上清，用200μL含1%FBS的PBS緩沖液重懸后進行流式細胞儀檢測，實驗重復3次。分析軟件為Flowjo 7.6.1，以CD11c陽性細胞設門，門內(nèi)標記CD11b+B220-為髓樣樹突狀細胞mDC亞群，CD11b-B220+為漿細胞樣樹突狀細胞pDC亞群。利用ELISA法檢測實驗組和對照組細胞懸液各組IL-12、TNF-α的分泌情況，具體方法參照BD公司ELISA試劑盒說明書。

2 結(jié) 果

2.1mDC與pDC細胞的分選時間:在培養(yǎng)過程中，DC細胞的OD450值(表示細胞總數(shù))先下降，至第5天時最低(0.51±0.03)，然后又上升，第9天達高峰(0.82±0.05)，后逐漸下降。mDC與pDC的占比在第0天為2.28%、1.42%，第4天為16.00%、8.29%，第8天為35.9%、27.00%，第14天為12.60%、33.7%。DC細胞OD450值的最大值在第9天(圖1)，mDC培養(yǎng)過程中占比最大值在第8天，35.9%，而pDC培養(yǎng)過程的占比最大值在第12天，33.7%(圖2)。結(jié)合培養(yǎng)過程中的細胞總數(shù)變化及mDC與pDC占比的變化，DC亞型細胞的最佳分選時間在培養(yǎng)的第8～9天。

圖1 不同時間DC細胞的OD450值

圖2 不同時間分選的mDC與pDC細胞亞型占比

2.2負載腫瘤細胞裂解物的mDC組細胞較pDC組分泌更多的細胞因子:在負載腫瘤細胞裂解物條件下，mDC組分泌的IL-12及TNF-α分別為(2119.58±118.06)pg/mL及(590.56±125.09)pg/mL，pDC組分泌的IL-12及TNF-α(671.24±41.59)pg/mL及(298.56±50.72)pg/m，mDC組細胞分泌的IL-12及TNF-α均高于相同細胞數(shù)量的pDC組(P<0.05)；且負載腫瘤細胞裂解物的mDC組與pDC組細胞分泌的細胞因子IL-12及TNF-α均高于未負載腫瘤細胞組(P<0.05)，見圖3及圖4。

2.3負載腫瘤細胞裂解物的mDC組細胞刺激淋巴細胞增殖能力較pDC組高:負載腫瘤細胞裂解物的mDC組刺激淋巴細胞增殖的能力(8.55±0.59)高于相同細胞數(shù)量下pDC組(6.93±0.40，P<0.05)；且負載腫瘤細胞裂解物的mDC組與pDC組細胞刺激淋巴細胞增殖的能力高于未負載腫瘤細胞組(P<0.05)，見圖5。

圖3 不同條件各組DC細胞亞群分泌細胞因子IL-12的情況

圖4 不同條件各組DC細胞亞群分泌細胞因子TNF-α的情況(*表示P<0.05，**表示P<0.005)

圖5 不同刺激條件下各組DCs細胞刺激淋巴細胞增殖的情況(SI表示刺激指數(shù)，*表示P<0.05，**表示P<0.005)

2.4負載腫瘤細胞裂解物mDC與pDC的鏡下形態(tài):將負載腫瘤細胞裂解物的mDC及pDC亞群進行單獨培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察可見mDC體積較大，細胞核不規(guī)則，且細胞周邊見較多的“突起”(圖6)；而pDC體積較小，呈類圓形，大部分細胞表面無“突起”(圖7)。

圖6 DC(倒置相差顯微鏡×400)

圖7 pDC(倒置相差顯微鏡×400)

2.5負載細胞裂解物的mDC與pDC組的免疫表型表達上調(diào):結(jié)果顯示，負載腫瘤細胞裂解物的mDC組表面CD80、CD86、CD40及MHC-Ⅱ類分子平均熒光強度值高于相同細胞數(shù)量的pDC組，且負載腫瘤細胞裂解物的pDC與mDC組細胞表面CD80、CD86、CD40及MHC-Ⅱ類分子的平均熒光強度值均高于未負載腫瘤細胞裂解物組。(圖8及圖9)。

圖8 負載腫瘤細胞裂解物前后的mDC亞群表面CD80、CD86、CD40及MHC-II類的表達變化

圖9 負載腫瘤細胞裂解物前后的pDC亞群表面CD80、CD86、CD40及MHC-II類的表達變化

3 討 論

在腫瘤的生物免疫治療研究中，樹突狀細胞(dendritic cells,DC)疫苗為目前研究最多、臨床應用開展最廣泛的免疫治療方法之一?，F(xiàn)研究表明，DC 是由數(shù)種亞群所組成的一個具有異質(zhì)性和多樣性的復雜生物系統(tǒng)，該系統(tǒng)中每一個DC 亞群在免疫反應中發(fā)揮著獨特的作用，共同參與對機體免疫應答的調(diào)節(jié)[7]。從來源上DC為mDC和pDC兩大類，其中mDC是研究最早和體內(nèi)分布最廣泛的一類樹突狀細胞，也稱常規(guī)樹突狀細胞(Conventional Dendritic Cells，cDCs)，其與粒細胞、單核巨噬細胞均由骨髓中的髓系祖細胞(Common Myeloid Progenitor，CMP)分化而來。mDC有典型的樹突狀形態(tài)，高度表達MHC-Ⅱ類分子及Toll 樣受體(Toll like receptor,TLR)，提呈抗原并刺激初始型T細胞增殖活化，參與機體免疫應答的啟動和調(diào)控。而pDC則是一類在自身免疫性疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及在機體抵抗病毒感染方面發(fā)揮著重要調(diào)控作用的免疫細胞，主要由骨髓中的淋巴系祖細胞(Common Lymphoid Progenitor，CLP)及髓系祖細胞(Common myeloid Progenitor，CMP)分化而來。由此可見，mDC與pDC細胞亞群在形態(tài)、免疫表型及生物學功能方面存在一定的差異。

研究表明，利用細胞因子Flt3-Ligand 在體外成功誘導出小鼠骨髓源性的pDC與mDC亞群，并對 pDC與mDC進行了初步的對比研究，但不能確定pDC 與mDC的分選時間，尚未對負載腫瘤細胞裂解物的pDC 與mDC分泌細胞因子、抗原提呈及刺激淋巴細胞增殖等生物學特性進行系統(tǒng)研究[8]。本研究利用rmFlt3-L的體外刺激誘導DC細胞分化成mDC與pDC細胞,然后將分選后的mDC及pDC細胞負載Lewis肺癌細胞裂解物，以比較各組細胞形態(tài)、免疫表型CD80、CD86、CD40 及MHC-Ⅱ類分子的表達變化、細胞因子IL-12及TNF-α的分泌情況及刺激淋巴細胞的增殖情況，以解決前期研究者的不足。我們在研究過程中選擇腫瘤細胞裂解物全抗原，是因為腫瘤細胞裂解物包含了全部潛在相關的抗原，從而避免了MHC限制及不需要特異性抗原表位，能降低免疫逃逸的風險。結(jié)果表明，在rmFlt3-L的體外刺激誘導下，小鼠骨髓細胞可分化成pDC與mDC細胞亞群，結(jié)合培養(yǎng)細胞數(shù)目及mDC與pDC的占比情況，從而確定了最佳分選時間為培養(yǎng)的第8～9d。負載腫瘤細胞裂解物的mDC與pDC均能分泌細胞因子和刺激淋巴細胞增殖，且mDC細胞的生物學功能強于pDC細胞。為了進一步明確mDC細胞的生物學功能強于pDC細胞的原因，后面我們對pDC及mDC細胞進行形態(tài)學觀察，發(fā)現(xiàn)兩者各具特點，其中pDC更類似于漿細胞或單核細胞，多數(shù)為圓形，表面突起較少，而mDC形態(tài)上則與單核細胞來源的樹突狀細胞類似，體積稍大，多為不規(guī)則形或圓形，胞膜可見較多突起，mDC細胞的形態(tài)較pDC成熟。同時負載腫瘤細胞裂解物的pDC與mDC組細胞表面CD80、CD86、CD40及MHC-Ⅱ類分子的平均熒光強度值均高于相同細胞數(shù)量的未負載腫瘤細胞裂解物組，且在負載腫瘤細胞裂解物的條件下，mDC組表面CD80、CD86、CD40及MHC-Ⅱ類分子平均熒光強度值高于相同細胞數(shù)量的pDC組。由此可見，負載腫瘤細胞裂解物的pDC也具有抗腫瘤的生物學功能，這與相關文獻一致的[9]，但mDC細胞的生物學功能強于pDC細胞，這與mDC細胞的形態(tài)成熟及共刺激分子表達上調(diào)有關。

綜上所述，在rmFlt3-L的體外刺激誘導下，小鼠骨髓細胞可分化成形態(tài)與功能不同的pDC與mDC細胞亞群，最佳的分選時間為培養(yǎng)的第8～9天。負載腫瘤細胞裂解物的pDC與mDC細胞亞群均具有分泌細胞因子及促進淋巴細胞增殖的生物學功能，且mDC細胞的生物學功能強于pDC細胞，這可能與mDC細胞的形態(tài)成熟與共刺激分子表達上調(diào)有關，為以DC細胞為基礎的免疫治療提供一定的理論基礎。