肖 敏 徐洪來 吳棟杰 覃衛(wèi)華 由長輝

(柳州市人民醫(yī)院1 皮膚科，2 肝膽外科，廣西柳州市 545006，電子郵箱：xuhonglai1973@163.com)

銀屑病是一種免疫介導(dǎo)的慢性炎癥性皮膚病，難以根治，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。全世界約有1.25億人患銀屑病[1]，在中國銀屑病的發(fā)病率約為0.1%～3.0%[2]。泛發(fā)性膿皰型銀屑病(generalized pustular psoriasis，GPP)是罕見且嚴重的銀屑病類型，該病起病突然，發(fā)展迅速，可導(dǎo)致繼發(fā)感染或心肺衰竭，甚至死亡[3]。因GPP的發(fā)病機制尚不清楚，所以治療難度大。目前，系統(tǒng)性藥物是治療GPP不可缺少的一部分。維A酸、免疫抑制劑和糖皮質(zhì)激素常用于治療GPP，但可導(dǎo)致肺纖維化、呼吸功能衰竭、肝腎功能受損和繼發(fā)感染等嚴重并發(fā)癥[3]。生物制劑是治療GPP的新興方法，但價格昂貴，也容易導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、上呼吸道感染、高血壓、炎癥性腸病和腫瘤等不良反應(yīng)，因此其長期安全性仍有待于進一步的臨床觀察[4]。此外，上述治療藥物只能獲得近期療效，不能防止GPP復(fù)發(fā)[5]。黃芩苷是從黃芩的干燥根中提取出的一種黃酮類化合物。既往研究顯示，使用黃芩苷有助于尋常型銀屑病皮損的消退，但其具體作用機制尚不清楚[6]。本研究探討黃芩苷對GPP患者機體Th1/Th2失衡及T盒子轉(zhuǎn)錄因子(T-box transcription factor，T-bet)/GATA 結(jié)合蛋白 3(GATA binding protein 3，GAGA-3)表達的影響，并分析其可能機制，為臨床治療GPP提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年2月至2019年11月在柳州市人民醫(yī)院皮膚科就診的36例GPP患者，所有患者皮損總面積均超過60%，表現(xiàn)為全身彌漫性紅斑、淺在淡黃色無菌性小膿皰及膿湖。排除標(biāo)準: (1)嚴重腦、心、肺、肝、腎損害者；(2)嚴重感染、免疫抑制和腫瘤患者；(3)妊娠期及哺乳期婦女；(4)近1個月內(nèi)接受過維A 酸類藥物、免疫抑制劑、全身糖皮質(zhì)激素及生物制劑等治療的患者；(5)皮損處局部用藥者。其中男性19例、女性17例；年齡20～55(38.36±8.92)歲；入院體溫 37.5℃～39.9℃(38.83±0.53) ℃。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查批準，所有患者對本研究知情且已簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器 淋巴細胞分離液LymphoprepTM(挪威Axis-Shield公司，批號：1114546)；TRIzol試劑(美國Invitrogen公司，批號：5346994)，細胞固定液/細胞破膜液(美國Invitrogen公司，批號：HH-V13241)；RPMI 1640培養(yǎng)基(美國HyClone公司，批號：SH30809.01B)，胎牛血清(美國HyClone公司，批號：021-60348065)，胰蛋白酶(美國HyClone公司，批號：SV30031)，青霉素及鏈霉素溶液(美國HyClone公司，批號：SV30010)，無菌磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS；浙江聯(lián)碩生物科技有限公司,貨號：K812-20L)；黃芩苷(南京源植生物科技有限公司，批號: 21967-41-9)；四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT) 試劑盒(武漢谷歌生物科技有限公司，貨號：G4101-1000T)；人白細胞介素 (interleukin,IL)-2(英國Abcam公司，批號：ab62926)，IL-4(英國Abcam公司，批號：ab215089)，IL-5(英國Abcam公司，批號：ab46026)，IL-6(英國Abcam公司，批號：ab246838)，IL-10(英國Abcam公司，批號：ab185986)，IL-13(英國Abcam公司，批號：ab272466)，γ-干擾素(英國Abcam公司，批號：ab224197)和腫瘤壞死因子β(tumor necrosis factor β,TNF-β;英國Abcam公司，批號：ab229202)酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒；實時熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司，批號：DRR420A)；上下游引物均由上海生工生物工程有限公司合成；藻紅蛋白抗人IL-4(美國eBioscience公司，批號：20191020)及藻紅蛋白抗人γ-干擾素(美國eBioscience公司，批號：20191205)。超凈工作臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，型號：SW-CJ-1FD/2F)；多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo公司，型號: Varioskan LUX )、CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司，型號: HERAcell 240i )；流式細胞儀(美國BD公司，型號：FACSCanto Ⅱ)；熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司，型號：LightCycler 96)。

1.3 實驗方法

1.3.1 外周血單個核細胞分離：抽取GPP患者晨起空腹肘靜脈血10 mL，放置于肝素鈉抗凝管中，1 000 r/min離心10 min，分離血漿，根據(jù)Ficoll密度梯度離心法[7]，用淋巴細胞分離液LymphoprepTM分離出外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。將PBMC放置于含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每隔1 d更換1次培養(yǎng)基，胰蛋白酶進行消化傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3.2 MTT法檢測黃芩苷對PBMC活力的影響：將PBMC接種于含有RPMI 1640完全培養(yǎng)基的96孔培養(yǎng)板中，接種密度為1×104個/孔，分為6組進行實驗，每組設(shè)6個平行孔，繼續(xù)置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；待PBMC貼壁后，棄去培養(yǎng)基，每孔分別加入含0 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL、400 μg/mL黃芩苷的RPMI 1640培養(yǎng)基100 μL，以0 μg/mL黃芩苷組培養(yǎng)的細胞作為陰性對照組，其余均為實驗組，繼續(xù)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后終止培養(yǎng)，棄去孔內(nèi)液體，更換不含黃芩苷的新鮮無血清RPMI 1640培養(yǎng)基，每孔加入5 g/L MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸除孔內(nèi)液體，每孔加入二甲基亞砜150 μL，振蕩10 min使結(jié)晶充分溶解，采用酶標(biāo)儀于570 nm波長下測定各孔光密度值，并計算細胞存活率。細胞存活率=(實驗組光密度值/對照組光密度值)×100%。選出最適宜的黃芩苷無毒研究濃度。

1.3.3 黃芩苷處理PBMC：隨機抽樣法選取6例GPP患者的PBMC，加入最適宜濃度黃芩苷處理細胞，以0 μg/mL黃芩苷培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞為陰性對照組，培養(yǎng)48 h，方法同1.3.2。

1.3.4 流式細胞術(shù)檢測Th1和Th2細胞比例：將1.3.3中的PBMC經(jīng)0.25%胰酶消化，PBS洗滌1 min后，3 000 r/min離心細胞30 s，棄上清液，再按上述方法洗滌離心細胞1次，棄上清液，再用PBS重懸細胞后，加入異硫氰酸熒光素抗CD4抗體(美國eBioscience公司，批號：20190515)進行表面染色，室溫避光孵育15 min后按操作要求加入固定液和破膜液，隨后加入藻紅蛋白抗人IL-4及藻紅蛋白抗人γ-干擾素，4℃孵育30 min，PBS洗滌2 次，1 min /次。使用流式細胞儀檢測Th1和Th2比例。

1.3.5 ELISA法檢測Th1和Th2細胞因子表達水平：取1.3.3的兩組PBMC，根據(jù)ELISA試劑盒說明書分別檢測細胞培養(yǎng)上清液中Th1分泌因子(IL-2、γ-干擾素、TNF-β)和Th2分泌因子(IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13)的表達水平。

1.3.6 實時熒光定量PCR法檢測PBMC中T-bet、GATA-3 的mRNA表達水平：收集1.3.3的兩組PBMC，利用TRizol法提取PBMC的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國默飛世爾生物科技有限公司，批號：K1622)。利用實時熒光定量PCR檢測試劑盒檢測T-bet和GATA-3的mRNA表達情況。T-bet上游引物序列為5′-GTTCCCATTCCTGTCATTTACT-3′，下游引物序列為5′-TCTCCGTCGTTCACCTCAA-3′；GATA-3上游引物序列為5′-CCTCATTAAGCCCAAGCGAAG-3′，下游引物序列為5′-TCCAGAGTGTGGTTGTGGTG-3′。以β-肌動蛋白作為內(nèi)參，β-肌動蛋白上游引物序列為5′-CAGCCATGTACGTTGCTATCCAGG-3′，下游引物序列為5′-AGGTCCAGACGCAGGATGGCATG-3′。反應(yīng)體系：10×Buffer 20 μL,dNTP 16 μL，上游引物6 μL，下游引物6 μL，Taq-酶10 μL，DdH2O 140 μL，模板DNA 2 μL。反應(yīng)條件：95℃ 3 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。根據(jù)2-ΔΔCt計算T-bet和GATA-3 的mRNA相對表達水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示，方差齊時多組間比較采用單因素方差分析，其中兩兩比較采用SNK-q檢驗，兩組間比較采用t檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 黃芩苷對GPP患者PBMC活力的影響 不同濃度黃芩苷組PBMC存活率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。300 μg/mL 、400 μg/mL黃芩苷組PBMC存活率均低于其他組，且400 μg/mL黃芩苷組PBMC存活率低于300 μg/mL組(均P<0.05)，見表1。因此選擇200 μg/mL作為最適宜的無毒研究濃度。

表1 不同濃度黃芩苷組PBMC存活率的比較(x±s，%)

2.2 兩組PBMC中Th1、Th2比例及其分泌的細胞因子水平的比較 與陰性對照組比較，200 μg/mL黃芩苷組的 Th1比例及其分泌的IL-2、γ-干擾素、TNF-β表達水平降低，而Th2比例及其分泌的IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13表達水平升高(均P<0.05)，見表2。

表2 兩組PBMC中Th1、Th2比例及其分泌的細胞因子水平的比較(x±s)

2.3 兩組PBMC中T-bet mRNA和GATA-3 mRNA相對表達水平的比較 200 μg/mL黃芩苷組PBMC細胞T-bet mRNA相對表達水平低于陰性對照組，GATA-3 mRNA相對表達水平高于陰性對照組(均P<0.05)。見表3。

表3 兩組PBMC中T-bet mRNA和GATA-3 mRNA相對表達水平的比較(x±s)

3 討 論

銀屑病可分為尋常型、關(guān)節(jié)病型、膿皰型和紅皮病型，其中膿皰型銀屑病約占所有銀屑病類型的1.0%[8]。膿皰型銀屑病又可分為GPP和局限性膿皰型銀屑病。GPP是銀屑病中最嚴重的類型[9]。該病是在無皮損的正常皮膚上或?qū)こＰ豌y屑病紅斑、丘疹、斑塊、鱗屑等皮損的基礎(chǔ)上，迅速出現(xiàn)針尖至粟粒大小的淡黃色無菌性小膿皰，分布密集，可融合成片狀膿湖，并快速發(fā)展至全身，患者常伴有寒戰(zhàn)、高熱、白細胞增多和低蛋白血癥等臨床表現(xiàn)。GPP還可并發(fā)銀屑病性關(guān)節(jié)炎，并與高血壓、糖尿病、高膽固醇血癥、代謝綜合征和肥胖等密切相關(guān)[10]。GPP的治療至今仍非常棘手，故尋找安全有效的GPP治療藥物是當(dāng)前研究的熱點[5]。

GPP以角質(zhì)形成細胞過度增殖為病理特點，皮損部位存在大量激活的T淋巴細胞，激活的T淋巴細胞可促進角質(zhì)形成細胞過度增殖和分化[11]。T淋巴細胞根據(jù)表面分化抗原的不同，可分為CD3+CD4+T淋巴細胞和CD3+CD8+T淋巴細胞，簡稱CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞。CD4+T淋巴細胞主要由Th構(gòu)成，初始 CD4+T淋巴細胞接受抗原刺激的信號，在不同的條件下可分化成不同的T淋巴細胞亞群，根據(jù)分泌的細胞因子不同，可分為Th1、Th2、Th17、Th9、Th22和調(diào)節(jié)性T細胞[12]。這些細胞各自具有不同的生物學(xué)功能。Th1可分泌IL-2、γ-干擾素、TNF-β等細胞因子，主要促進細胞免疫應(yīng)答，表現(xiàn)為：增強吞噬細胞的吞噬和處理抗原功能，參與細胞毒作用和遲發(fā)型超敏反應(yīng)性炎癥，IL-2可促進細胞毒性T細胞的活化。Th1的持續(xù)性強應(yīng)答參與特異性自身免疫性疾病、不明原因的慢性炎癥性疾病、接觸性皮炎、遲發(fā)型超敏反應(yīng)性疾病、急性同種異體移植排斥反應(yīng)等的發(fā)生和發(fā)展[13]。Th2可分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13等細胞因子，主要促進體液免疫應(yīng)答，表現(xiàn)為：誘導(dǎo)B淋巴細胞分化為漿細胞產(chǎn)生抗體，趨化B細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞等，其中IL-4能促使B淋巴細胞所合成的抗體向IgE和IgG1轉(zhuǎn)換。Th1和Th2之間存在互相制約和調(diào)節(jié)的復(fù)雜關(guān)系：Th1所分泌的γ-干擾素可抑制Th2增殖和分化，而Th2所分泌的IL-4和IL-13可共同抑制Th1的功能和分化，且Th2所分泌的IL-10可明顯抑制Th1分泌細胞因子，并間接促進Th2分化[14]。微環(huán)境中細胞因子調(diào)控的Th1和Th2分化具有重要臨床意義。正常機體內(nèi)，Th1和Th2維持著動態(tài)平衡。銀屑病患者Th1功能增強，而Th2功能受到抑制，因此體內(nèi)常檢測到大量Th1存在，并高表達Th1相關(guān)細胞因子，導(dǎo)致Th1和Th2出現(xiàn)嚴重失衡(又稱偏移)[15]。因此，通過改變局部微環(huán)境中細胞因子的組成，即將細胞因子微環(huán)境中的Th1向Th2推動，可能成為對銀屑病進行干預(yù)的有效手段[16]。

多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控著Th1、Th2的分化，其中以T-bet和GATA-3最為重要[17]。T-bet又稱為TBX21，位于人基因的17號染色體上，于2000年被發(fā)現(xiàn)，屬于T-box家族新成員[18]。T-bet選擇性地表達于Th1，通過激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子1通路，促進Th0向Th1分化。T-bet基因和γ-干擾素之間有高度的相關(guān)性：T-bet基因可轉(zhuǎn)錄激活γ-干擾素基因，誘導(dǎo)內(nèi)源性γ-干擾素的生成和γ-干擾素等位基因的染色體重排，促進γ-干擾素的表達上調(diào)；而γ-干擾素可正反饋調(diào)節(jié)T-bet的表達水平，形成一個自分泌反饋環(huán)[19]。T-bet能夠抑制Th1向Th2分化，并抑制Th2相關(guān)細胞因子的合成，達到抑制Th2分泌IL-4的效果，因此，T-bet被認為是Th1定向分化的標(biāo)志性基因[20]。GATA-3屬于GATA轉(zhuǎn)錄因子家族，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的鋅指蛋白。GATA-3在Th0中呈低表達，其作用與T-bet相反，對Th1分化成熟有抑制作用，并抑制γ-干擾素的表達；同時，γ-干擾素的生成減少也降低了GATA-3的水平[21]。GATA-3能夠推動Th0向Th2分化，抑制T-bet的表達從而抑制Th1反應(yīng)，促進Th2反應(yīng)，誘導(dǎo)分泌Th2 相關(guān)細胞因子。GATA-3的表達上調(diào)可能是通過IL-4/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子6通路實現(xiàn)，IL-4、IL-5和IL-13的基因啟動子區(qū)域均包含GATA-3的結(jié)合位點。因此，GATA-3在Th2極化過程中起著關(guān)鍵作用[22]?？傊琓h0向Th1分化時，T-bet表達上調(diào)，GATA-3表達下降；Th0向Th2分化時，GATA-3表達上調(diào)，T-bet表達下降[23]。由此可見，T-bet/GATA-3可作為準確反映Th1/Th2失衡與漂移的指標(biāo)。

黃芩的功效為清熱除濕、瀉火解毒，毒性低、副作用小且價格低廉。黃芩苷是黃芩中最有效的化學(xué)成分之一。黃芩苷具有降壓、抗變態(tài)反應(yīng)、抑菌、抗炎、抗腫瘤等藥理作用，可用于心血管疾病、腦缺血、肝炎、肺炎、感染和腫瘤等疾病的治療[24]。隨著對黃芩苷分子機制的深入研究，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)黃芩苷可參與細胞的增殖、分化、凋亡和炎癥反應(yīng)等過程，并通過調(diào)節(jié)炎癥信號通路抑制多種炎癥因子的表達，是一種應(yīng)用前景較好的抗炎藥物[25]。近年來有研究顯示，黃芩苷能抑制角質(zhì)形成細胞的活力，對銀屑病具有較好的治療效果[6]。但黃芩苷治療膿皰型銀屑病的作用機制，目前尚不清楚。

本研究結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，200 μg/mL黃芩苷組的 Th1細胞比例及IL-2、IFN-γ、TNF-β表達水平降低，而Th2細胞比例及IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13表達水平升高(P<0.05)，說明黃芩苷對GPP患者體內(nèi)Th1/Th2的免疫失衡具有調(diào)節(jié)作用，能下調(diào)Th1水平，抑制Th1相關(guān)細胞因子的表達，同時上調(diào)Th2水平，促進Th2相關(guān)細胞因子的表達，能夠促進過度反應(yīng)的 Th1向Th2漂移，達到兩者間的平衡。此外，200 μg/mL黃芩苷組PBMC中T-bet mRNA相對表達水平低于陰性對照組，GATA-3 mRNA相對表達水平高于陰性對照組(P<0.05)，表明黃芩苷能抑制GPP患者PBMC中Th1轉(zhuǎn)錄因子T-bet mRNA的表達，并促進Th2轉(zhuǎn)錄因子GATA-3 mRNA的表達。這也側(cè)面反映了T-bet 參與了Th1的分化過程，促進了Th0向Th1分化；GATA-3參與了Th2的分化過程，促進了Th0向Th2分化。

綜上所述，黃芩苷能抑制Th1相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子T-bet的表達，下調(diào)Th1細胞水平，并增強Th2相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GATA-3的表達，上調(diào)Th2細胞水平，從而促進Th1細胞向Th2漂移，調(diào)節(jié)Th1/Th2的失衡。