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        層析技術(shù)在血液制品分離純化中應(yīng)用的探討

        2021-10-26 03:13:26黃喜佳
        康頤 2021年12期

        黃喜佳

        【摘要】文章主要是分析了我國(guó)的血液制品現(xiàn)狀,在此基礎(chǔ)上講解了層析技術(shù)的原理和分類,最后探討了其在血液制品中的實(shí)際應(yīng)用,望可以為有關(guān)人員提供到一定的參考和幫助。

        【關(guān)鍵詞】層析技術(shù);血液制品;分離

        【中圖分類號(hào)】R945 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【DOI】10.12332/j.issn.2095-6525.2021.12.211

        前言

        當(dāng)前我國(guó)社會(huì)的多元化發(fā)展,使得以往采用單一低溫乙醇法所制造出來(lái)的血液制品已經(jīng)無(wú)法滿足當(dāng)前人們對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的需求,層析技術(shù)能夠有效提高到血漿的利用率和質(zhì)量,且有效解決成本,為此文章主要是對(duì)層析技術(shù)在血液制品分離中的實(shí)際應(yīng)用情況展開(kāi)了研究和探討。

        1 血液制品現(xiàn)狀

        血液制品是指血漿蛋白質(zhì)組分、分離、純化或重組 DNA 的技術(shù)和血細(xì)胞,用于治療和預(yù)防的重大疾病,由于治療和預(yù)防的發(fā)展和應(yīng)用,在過(guò)去的幾十年中血液制品用于治愈和控制疾病,隨著世界各國(guó)對(duì)疾病的深入研究和對(duì)血液制品的開(kāi)發(fā),目前按照對(duì)血液制品的不同作用可分為人血白蛋白、免疫球蛋白、凝血因子、特殊蛋白和纖維蛋白粘合劑五大類。其中,免疫球蛋白在全球市場(chǎng)占有率最高,占 43%。其他成分的市場(chǎng)份額為凝血因子 17%,白蛋白 13%,其他成分 27%;據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,我國(guó)白蛋白市場(chǎng)占有率為 75%,其次是免疫球蛋白(25%),其余為 5%。除市場(chǎng)供求關(guān)系外,造成上述產(chǎn)品市場(chǎng)占有率不同的另一個(gè)重要因素是分離技術(shù)。

        2 層析技術(shù)的原理和分類

        2.1 層析技術(shù)的原理

        目前使用層析技術(shù)廣泛,俄羅斯植物 M..Tswett 在本世紀(jì)發(fā)現(xiàn)該技術(shù)表明該植物的葉片還含有其他葉綠素和生物學(xué)?;瘜W(xué)有效的分離分析工具也含有生物學(xué)的生物學(xué)和其他學(xué)科,層析技術(shù)是由物理和化學(xué)性質(zhì)的不同物質(zhì)建立的技術(shù),并且所有層析系統(tǒng)由兩個(gè)階段組成:一種是固定階段或固定物質(zhì)或固定在固體物質(zhì)中。另一個(gè)是除固定的物質(zhì)外的其他物資,即其他是流動(dòng)階段,即一種可以流動(dòng)的物質(zhì),例如水和各種介質(zhì)。當(dāng)要分離的混合物通過(guò)溶劑(流動(dòng)相)分離時(shí),由于每個(gè)組分的物理和化學(xué)性質(zhì)的差異,每種組分(吸附,溶解,結(jié)合等)的物理和化學(xué)性質(zhì)的差異(吸附,溶解,結(jié)合等),兩種組分的依賴分布(含量比較)是不同的。當(dāng)溶劑向前移動(dòng)時(shí),每個(gè)組分在兩個(gè)階段連續(xù)重新發(fā)布,與固定相的相互作用較弱相位,阻塞效果越小,移動(dòng)相位運(yùn)動(dòng)的前向移動(dòng)速度越快。相反,與固定相的相互作用強(qiáng),則前向運(yùn)動(dòng)速度很慢。

        2.2 分類

        2.2.1 薄層層析

        薄層層析(TLC)是一種簡(jiǎn)單,快速和跟蹤的層析技術(shù)。一般而言,柱層析中使用的吸附劑在平坦表面(例如玻璃板)上鋪展以形成薄層。TLC 原理類似于柱層析技術(shù)。薄層層析(TLC)由于其高分辨率,致密色斑和肉眼可見(jiàn)的低濃度,逐漸替換 Pharmacopoeia 中的 PC。TLC的主要優(yōu)點(diǎn)是經(jīng)濟(jì)性和簡(jiǎn)單性。這種方法的主要缺點(diǎn)是,盡管它可以滿足許多限制測(cè)試的要求,但可視測(cè)量的主體性強(qiáng)烈,此方法最多可以是半定量的。TLC 的極限試驗(yàn)列在藥典的不同標(biāo)題下。在極限測(cè)試中最常見(jiàn)的 TLC 方法是檢測(cè)兩個(gè)濃度水平的物質(zhì)。稀釋溶液代表雜質(zhì)的最大允許濃度。因此,不需要參考樣品。FairBloom(1984)審查了 TLC在藥房的應(yīng)用技術(shù)和應(yīng)用范圍。后者包括雜質(zhì)檢測(cè),藥物穩(wěn)定性,制備分析,體液中的藥物,抗生素,天然產(chǎn)物,表面活性劑,化妝品,脂質(zhì),添加劑等。未知藥物的有效成分為毒或無(wú)標(biāo)記的白色片劑,在一個(gè)完整的標(biāo)準(zhǔn)中,是完全不可能的,盡管 TLC 由于實(shí)驗(yàn)條件的限制,提供了一個(gè)簡(jiǎn)單快速的鑒別方法,TLC 提供了一個(gè)簡(jiǎn)單快速的鑒別方法。DHONT報(bào)告說(shuō),校正后的 RF 值與實(shí)驗(yàn)室的中間區(qū)域進(jìn)行通信。只有兩種對(duì)照品可以進(jìn)行具體的實(shí)驗(yàn),并且可以計(jì)算出校正因子的個(gè)數(shù),因此該方法可以用于其他實(shí)驗(yàn)室。比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果,與 Moffatt 等人的 794 薄層層析系統(tǒng)可以用來(lái)鑒別抗組織胺、磺胺等藥物。

        2.2.2 高效薄層層析

        高效薄層層析技術(shù)的定量分析可能比高效液相層析技術(shù)昂貴,但它具有操作簡(jiǎn)單、進(jìn)樣速度快等優(yōu)點(diǎn),使得對(duì)每個(gè)樣品的分析都非常經(jīng)濟(jì)有效。1985 年國(guó)際會(huì)議指出,TLC 和 HPTLC 在準(zhǔn)確度、通用性、精密度和靈敏度等方面與 GC 和 HPLC 相當(dāng)或優(yōu)于 GC 和 HPLC。例如,薄層層析技術(shù)和高效薄層層析技術(shù)可用于沙丁胺醇的藥代動(dòng)力學(xué)研究,比氣相層析 - 質(zhì)譜法測(cè)定更快。用于控制抗生素生產(chǎn)發(fā)酵過(guò)程的單一半自動(dòng) TLC 系統(tǒng)可提供與 8 個(gè) HPLC 系統(tǒng)相同的數(shù)據(jù)量。RITHRC通過(guò) HPTLC 審查了對(duì)體液中藥物及其代謝物的定量分析。液體萃取與薄層層析相結(jié)合,已用于藥物制劑和生物中的藥物的快速鑒定。在法定分析中,常規(guī)柱層析(使用玻璃柱)通常用作預(yù)處理純化操作(例如分光光度法)的另一種分析方法。對(duì)于痕量污染物的檢測(cè)和測(cè)定,GC 和HPLC 通常比其他方法更好。但是,如果這些化合物不能從柱中洗脫,GC 和 HPLC 不像 TLC 一樣好。因此,GC 或 HPLC 的選擇取決于分析化合物的物理化學(xué)性質(zhì),樣品的類型和所需的檢測(cè)濃度。

        2.2.3 氣相層析

        在藥物和溶劑中測(cè)定不同處方藥中藥物的含量,主要用 1-3mm 長(zhǎng)的填充柱進(jìn)行分析,分離出的化合物用火焰離子檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè),適用于多種藥物,包括抗剝落劑、抗強(qiáng)效劑、鎮(zhèn)痛劑、三環(huán)抗鍵合液、苯、中樞神經(jīng)興奮劑、抗腫瘤藥、抗生素、利尿劑等。氣相層析技術(shù)作為檢測(cè)手段,與質(zhì)譜法一樣,在其它技術(shù)中也能獲得定性和定量信息。該方法主要用于常規(guī) GCS,其無(wú)法獲得足夠的揮發(fā)性分析,PGC 在藥物的階段非常有意義,并且已經(jīng)應(yīng)用于微生物和真菌鑒定,臨床分析(對(duì)于一些代謝反索賠 /MS),有毒藥物,藥物分析(如波巴酸鹽,嗎啡,硫化物,青霉素和頭部等)。

        2.2.4 高效液相層析

        高效液相層析是藥物分析中應(yīng)用最廣泛的分析方法,該技術(shù)本身可以幫助實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化,最好的系列型號(hào)包括自動(dòng)進(jìn)樣、三元或四梯度溶劑系統(tǒng)、柱轉(zhuǎn)換裝置和二極管陣列或快速掃描檢測(cè)器、全電子計(jì)算機(jī)、計(jì)算專用的測(cè)量數(shù)據(jù)處理設(shè)備和打印報(bào)表。目前設(shè)計(jì)的結(jié)果在高效液相層析儀、專門用于藥品質(zhì)量控制的高效液相層析儀、傅立葉變換紅外檢測(cè)與開(kāi)發(fā)以及相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)使用設(shè)備,以及非常強(qiáng)大的分析工具。在許多高效液相層析應(yīng)用中,不需要進(jìn)一步純化樣品,而需要去除由于物理體積和化學(xué)行為(如蛋白質(zhì)和脂質(zhì))而損壞層析柱的雜質(zhì)。簡(jiǎn)單溶液(如進(jìn)樣)可直接進(jìn)樣或稀釋至適合檢測(cè)器檢測(cè)范圍的濃度。糖漿也需要稀釋,片劑和膠囊需要在超聲波浴中加工,并過(guò)濾以去除異常物質(zhì)。雖然乳膏和軟膏可以用保護(hù)柱直接注射,但最好事先分離親脂性物質(zhì)。

        3 血液制品分離技術(shù)背景

        20 世紀(jì) 40 年代,血液制品首次用 COHN 低溫乙醇分離純化,這一純化技術(shù)的深遠(yuǎn)影響是世界血漿蛋白大規(guī)模生產(chǎn)的基礎(chǔ),但當(dāng)前科學(xué)技術(shù)和社會(huì)多樣化的需求,只有原有的分離技術(shù)帶來(lái)的產(chǎn)品不能滿足社會(huì)的需要,所以用這項(xiàng)技術(shù)來(lái)分離純化血液制品,新技術(shù)已應(yīng)用于血液制品的分離純化,如離心、酸沉淀、過(guò)濾、層析、超濾等。其中,層析技術(shù)的應(yīng)用從根本上改變了原始技術(shù)的缺點(diǎn),如長(zhǎng)分離時(shí)間,分離效果不佳,產(chǎn)品類型少,自動(dòng)化程度低,有效提高了原料血漿的利用率和安全性,并豐富了產(chǎn)品類型。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,20 多種產(chǎn)品已從國(guó)外有效地分離出來(lái),其中 10 個(gè)以上是在研發(fā)或臨床試驗(yàn)的階段。但是,由于中國(guó)分離技術(shù)的延遲開(kāi)始,雖然大多數(shù)企業(yè)在血液產(chǎn)品的分離和純化中也引入了層析技術(shù),但大多數(shù)都還是處于一個(gè)實(shí)驗(yàn)階段,并未正式應(yīng)用在一些大型工業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中。目前我國(guó)的血液制品仍以低溫乙醇為主,產(chǎn)品僅限于血漿、免疫球蛋白、纖維蛋白原和凝血因子 VIII,如何通過(guò)層析分離,改變分離技術(shù)的技術(shù)分析,提高分離效果,增加血液分離成分是血液制品的研究重點(diǎn),本文通過(guò)我國(guó)分析技術(shù)在血液制品分離純化中的應(yīng)用,并結(jié)合實(shí)際血液制品的現(xiàn)狀進(jìn)行總結(jié),為后續(xù)的研究提供到了可靠的依據(jù)。

        4 層析技術(shù)的應(yīng)用

        4.1 白蛋白

        當(dāng)前生物柱層析理論的不斷發(fā)展,包裝的類型和設(shè)備水平的改善,層析技術(shù)越來(lái)越廣泛。其中,葡聚糖凝膠沒(méi)有任何物質(zhì)交聯(lián),瓊脂糖凝膠的凝膠層析技術(shù),交聯(lián)陰離子交換配體(如 DEAE,QAE)或陽(yáng)離子交換配體(CM,P,SP)離子交換和特定親和交聯(lián)賴氨酸,明膠,肝素和其他親和層析是最廣泛使用的血液產(chǎn)品的分離方法。這是應(yīng)用這些層析技術(shù),使得產(chǎn)品或組件的有效分離。理想的粗產(chǎn)物或儲(chǔ)備溶液可以僅在幾個(gè)過(guò)程中獲得。通過(guò)脫鹽,離子交換和分子篩由冷凍血漿制備白蛋白和纖維蛋白原;此外,通過(guò)膨脹的床技術(shù)分離白蛋白,纖維蛋白和纖維蛋白,通過(guò)膨脹的床技術(shù)分離 – 為這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)了層析分離在血液產(chǎn)品中的重要性和可操作性。白蛋白是血漿蛋白中最重要的蛋白質(zhì),3500-5500mg/dl 是從血漿中分離的第一種蛋白質(zhì),其廣泛用作臨床治療中的血漿擴(kuò)容器。對(duì)血清白蛋白產(chǎn)品中雜質(zhì)的不確定性,越來(lái)越多的研究者希望通過(guò)基因技術(shù)和細(xì)胞技術(shù)生產(chǎn)重組白蛋白,以克服上述問(wèn)題,如原核表達(dá)和蛋白質(zhì)異常折疊等,從血白蛋白中分離純化重組白蛋白是一種有效可行的方法。如今,常用的層析分離技術(shù)主要用于低溫乙醇層析,純化血液制品,如 1993 年 CLS 公司的 YAP。乙醇結(jié)合層析可以改善制備條件,縮短生產(chǎn)周期,促進(jìn)工業(yè)生產(chǎn)。基本技術(shù)是通過(guò)乙醇沉淀制備血漿。組分 II 和 III 上清液是超級(jí)化的,S200 凝膠柱層析。半純產(chǎn)品的蛋白質(zhì)含量,重新分配和乘客消毒純產(chǎn)品可達(dá)到 99.5%,高于低溫乙醇法制備的高于 90% 的制備。

        4.2 內(nèi)毒素及病毒的去除

        在血漿中,免疫球蛋白是另一種富含的蛋白質(zhì),主要用于由自身抗體不足引起的疾病的臨床治療。當(dāng)前 IVIG 的研究和應(yīng)用,更改善的COHN 方法或 KISTLER.NITSCHMANN 方法,LIU 等人報(bào)道已用于免疫球蛋白分離技術(shù)。只有在溶解冷沉淀件組分后,已經(jīng)使用了不同的沉淀方法,如果我們使用聚乙二醇沉淀,聚乙二醇再沉淀,乙酸沉淀,然后溶解,含有多肽的 AF- 氨基 650m 凝膠柱可以是親和層析有利于隨后的分離。雖然血液制品的原料來(lái)自健康人的血液,但目前的檢測(cè)方法仍然有限,不能完全保證血源的安全,因此,據(jù)報(bào)道,使用血液制品會(huì)引起血液傳播病毒,如 HIV、EB、HBV、HCV 等,因此,Horowitz 等人認(rèn)為,除了加強(qiáng)原料的檢測(cè)外,病毒在制備過(guò)程中也是非常重要的,S/D 是FDA批準(zhǔn)的用于病毒滅活的,但是后來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)S/D方法只對(duì)脂質(zhì)包膜的病毒有效,這意味著S/D方法對(duì)甲型肝炎和其他病毒沒(méi)有影響一些研究表明應(yīng)該用辛酸鈉來(lái)滅活。

        5 結(jié)束語(yǔ)

        由上可知,為可以適應(yīng)當(dāng)時(shí)市場(chǎng)的變化,我們可以吸取到國(guó)外一些先進(jìn)純化的工藝,才能夠有效創(chuàng)新和完善到我國(guó)的生產(chǎn)工藝和技術(shù)水平,最終有效提升產(chǎn)品的質(zhì)量以及種類。

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