黃錦程

【摘要】凝血因子Ⅷ是治療血友病的常見類型，具有良好的耐藥性、安全性和療效。由于凝血因子Ⅷ的半衰期相對較短，通常需要大劑量預防和治療出血，以及頻繁輸血，本文綜述了延長凝血因子Ⅷ半衰期的研究進展和最重要的技術方法。人凝血因子是人血漿中一種重要的蛋白，用于降低出血的風險。是人體凝血的激活途徑的重要蛋白組分之一。低凝血因子Ⅷ水平可導致不同程度的凝血障礙。目前，血漿冷沉淀在我國主要用作血漿凝血因子Ⅷ儲存的原料，也可以用離子交換法進行凈化。采用血漿收集、熔化、離心冷卻。研究了離子交換層析、病毒滅活和冷凍干燥，主要針對這些方面展開研究。

【關鍵詞】人類;凝血因子Ⅷ;研究;進展

【中圖分類號】R973 ? 【文獻標識碼】A 【DOI】10.12332/j.issn.2095-6525.2021.12.209

前言

凝集素是人體血漿中最重要的蛋白質(zhì)之一，也是靜脈血液循環(huán)的重要組成部分。目前，血液中凝血因子Ⅷ水平較低是甲型血友病的指標，根據(jù)世衛(wèi)組織預防血友病的數(shù)據(jù)可能會有不同的水平，它是凝血因子Ⅷ編碼基因突變導致該凝血因子功能缺陷所致的一種凝血功能障礙性遺傳病全世界每10000人中有1人發(fā)病。隨著檢測手段的普及，更多的患者被發(fā)現(xiàn)，數(shù)據(jù)顯示，盡管凝血因子Ⅷ供應量有所上升，但國內(nèi)仍存在供不應求的問題。中國一直在進口凝血因子Ⅷ很多年了。造成我國凝血因子短缺的主要原因是生產(chǎn)技術，比如上海生物制品研究所有限公司的FVIII產(chǎn)品就可以生產(chǎn)。考慮到國家政策的影響，有必要開發(fā)一條新的血漿生產(chǎn)線。在開發(fā)的同時生產(chǎn)研制凝血因子Ⅷ， 應加快產(chǎn)品的市場推廣，對冷藏和溶出的制備進行了研究。

1 ?FⅧ的結構與性質(zhì)

1.1結構

FⅧ主要由肝細胞組成。前體含有2351個氨基酸，這些氨基酸從內(nèi)網(wǎng)中去除，形成硫鍵和N-糖基化。一個B場和兩個C場在A1、A2和A3之后有較短的酸性區(qū)，而f場在A1、A2和A3之后有較短的酸性區(qū)Ⅷ序列域是一個高水平的N-糖基化區(qū)，與F無關Ⅷ 活動，但只能通過身體的加工和分泌;在A2和A3地區(qū)，硫化酪蛋白被用作FⅧ的附加因子。大多數(shù)FⅧ在b-a3或b區(qū)被分成兩條獨立的鏈，輕鏈由a3-c1-c2組成;重鏈由a1-a2和B區(qū)組成。B區(qū)的長度隨B區(qū)的長度而變化。同時，一些金屬離子（如Ca′或Mn）可以通過改變蛋白質(zhì)含量進行配位，F(xiàn)VI與vwF-a3（和C2）結合的關鍵在于，F(xiàn)VI與vWF的結合覆蓋了FVI、vWF-FⅧ和磷酸鹽的接觸點，以防止F的去除Ⅷ 磷脂，防止x-酶復合物的形成，保護fⅧ 從激活FXa和活性蛋白C，延長體內(nèi)半衰期。

1.2活化與失活

FⅧ被激活為FⅧ通過己糖或FXa。凝集酶與重鏈中的a1-a2和a2-b結合，與輕鏈N端的Arg 1689結合，在這些區(qū)域，切斷FVI的作用。FXa與血栓形成的機制相同，但也有不同于血栓形成的跡象。FXa與C2的相互作用可能影響重鏈的分裂，而C2不影響血小板酶的分裂;活化后，F(xiàn)Ⅷ和vWF重組形成三個組合;活化后，F(xiàn)Ⅷ與磷脂固定劑和Ca2+相互作用形成酶因子X，兩組疏水基團被用于磷酸雙層膜，當一系列a-殘基相互作用形成鹽橋時，F(xiàn)Ⅷ a大大提高了FX的催化效率。FⅧA和FX由鹽橋通過靜電有源f來控制Ⅷ A是非常不穩(wěn)定的，A2區(qū)域可以很容易地從這三種組合中分離出來。一些新的重組FⅧ提高了穩(wěn)定性，一種防止A2解離的方法是在f的半衰期內(nèi)保留一個小片段Ⅷ 在輕鏈A3中，硫酸和A2之間的共價鍵可以通過基因突變而增加另一種可能的生命損失是活化蛋白A的水解。APC將A2分為arg562，將A1分為arg336。然而，arg336的分裂改變了A1和A2之間的相互作用，導致因子活性的喪失和高血栓含量Ⅷ 保持凝血和抗凝劑的平衡。

2 ?FVIII的制備

2.1概述

1965年美國開發(fā)了一種在封閉無菌系統(tǒng)中從單個血漿生產(chǎn)冷沉淀制劑的方法。但是，冷沉淀制劑的比活性尚不確定，其純度低，含有血型微粒和抗體，可引起過敏反應。70年代以后，發(fā)展了以冷沉淀為原料制備分離純化的方法，90年代用單克隆抗體親和層析技術制備了兩種高純度的FⅧ制劑。單抗親和層析法具有收率高、成本低等優(yōu)點。FⅧ制劑的純度不斷提高，生產(chǎn)過程中進行嚴格的病毒活化處理，目前在臨床上廣泛應用。所有產(chǎn)品均來自人血漿，主要使用離子交換色譜法從人血漿冷凍沉淀液中分離純化。

2.2離子交換色譜法

以往的沉淀法如聚乙二醇沉淀法和甘氨酸沉淀法生產(chǎn)的FⅧ純度較低。纖維蛋白原（FG）、纖維連接蛋白（FN）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白G（IgG）含量較高，F(xiàn)Ⅷ含量不到總蛋白的1%。先驅(qū)采用凝膠色譜法生產(chǎn)高純度FⅧ制劑，冷凍沉淀液溶解后用氫氧化鋁吸附去除維生素K依賴性凝血因子，殘渣吸附在柱上。由于其大孔徑和弱疏水性，樹脂對FⅧ有很強的結合力。該方法可使傳統(tǒng)FⅧ制劑的純度提高200倍，產(chǎn)品穩(wěn)定性高。國內(nèi)幾家廠商經(jīng)常采用這種生產(chǎn)工藝或在此基礎上進行優(yōu)化和進一步改進。

2.3基因工程法

重組凝血因子FⅧ是第一個利用DNA人工重組技術生產(chǎn)和銷售的重組凝血因子。類似天然FⅧ的生化特性已成為許多發(fā)達國家最重要的藥物。FVIII位于X染色體長臂的末端，重組長度FⅧ代表機體的重組，它是將整個人類DNA序列的表達包含在向量機中產(chǎn)生的。以微粒子為表達載體，對克隆進行了高度檢測。在沒有血清培養(yǎng)的情況下，加入牛胰島素、人蛋白和蛋白酶抑制劑。細胞分批培養(yǎng)，經(jīng)親和層壓和二級離子交換純化。由于FⅧ的結構域不影響其活性，而結構域B的缺失導致其表達量增加了20倍，因此FⅧ該結構域中缺失的產(chǎn)物被開發(fā)出來。培養(yǎng)基中還含有人血清蛋白和重組胰島素500升培養(yǎng)液。培養(yǎng)是一種連續(xù)注射法。當細胞密度達到上限時，溫度轉(zhuǎn)化為溶解氧，油酸酯進入生產(chǎn)階段，殘渣不斷積累。殘渣經(jīng)S/D破壞后，通過各種色譜程序進行純化，然后冷凍干燥得到。

3 ?過程

3.1血漿采集保存

生物血漿是一種通過一次提取獲得的健康人體血漿，用于生產(chǎn)血漿蛋白原代血漿是血漿蛋白公司的生命線低溫儲存在血漿采集過程中影響原血漿中FⅧ的活性，影響FⅧ活性的因素很多，包括貯藏溫度、pH值、血漿中無機鹽離子、微球等蛋白質(zhì)參與制造過程，影響FⅧ的穩(wěn)定性。結果表明，檸檬酸鹽含量對FⅧ的穩(wěn)定性有影響，檸檬酸鹽能與Ca2+血漿結合。Ca2+的減少導致了FⅧ層的不穩(wěn)定性。冷凍原始血漿是一個非常重要的步驟。影響血漿冷凍的因素包括冷凍時間、冷凍速度、血漿收集容器的形狀、體積和厚度。通過時間和溫度的結合，不穩(wěn)定成分如FⅧ的損失可以最小化?？焖倮鋮s或一次提取血漿可防止或減少血漿中FⅧ的丟失，血漿的緩慢凍結表明大部分FⅧ已丟失;冷凍血漿的最佳儲存溫度不高于-30，冷凍血漿的最佳儲存溫度為-2。血漿快速冷凍需要2小時，核溫度不低于-20，對凝血活性有很大影響。血漿損耗因子很快，因此需要冷鏈加料系統(tǒng)來控制原血漿傳輸過程的質(zhì)量。

3.2冷沉積

冷沉淀是以新鮮冰凍血漿經(jīng)低溫解凍制成的白色片狀制劑，含有纖維蛋白、纖維化連接物、FX等;目前，國內(nèi)血管中心水浴虹吸式熔融控制、CPC熔融離心、FFP室溫凝固5分鐘，然后用雙袋軟化管，將血漿溶解于水浴中，從血袋中取出60ml冰，離心，在冷沉淀中沉淀約25ml下層。熔點數(shù)字控制是指在室溫下軟化管后，F(xiàn)FP設定5分鐘，但血漿在水浴中形成一定的滴高;多余的血漿堆積在空袋中，剩余的40-50毫升冷凍血漿堆積在冷血沉積物中。與虹吸法相比，離心法對FⅧ、纖維蛋白原和VWF的提取率較高。離心水浴用于控制初始溫度和熔化時間。在解凍過程中，采用圓形槽進行解凍，以保證血漿包的溫度均勻性。

4 ?半衰期延長的方法

4.1緩釋

持續(xù)釋放是為了延緩凝血因子Ⅷ的釋放速率，并通過一定的處理降低藥物進入血液的速率，以進一步提高蛋白質(zhì)的生物利用度和穩(wěn)定性。脂質(zhì)體用于將蛋白質(zhì)包裹在磷脂囊泡中，并將其與外部載體結合。重組FⅧ已被納入長循環(huán)脂質(zhì)體中。因子Ⅷ的半衰期可延長1.5～1.6倍。該方法的優(yōu)點是可以長時間釋放活性和未修飾的蛋白質(zhì)。

4.2.化學改性

該方法的目的是通過化學改性延長F-Ⅷ的半衰期，防止和消除壽命損失。在這種方法中，與親水性聚合物相關的特定蛋白質(zhì)分子通常被聚乙二醇和有機硅修飾，也稱為PEG修飾。聚乙二醇（PEG）是一種由環(huán)氧乙烷形成的可與蛋白質(zhì)分子中活性物質(zhì)基團結合的重復鏈。偶數(shù)連接后，與2-3個水分子結合;這不僅提高了蛋白質(zhì)在水中的溶解度，而且增加了其分子量。腎臟根據(jù)物質(zhì)的大小進行過濾，這樣加入分子量的聚乙二醇后，蛋白質(zhì)的脫落實際上會減慢;球形結構，作為保護肽，防止蛋白質(zhì)分解;同時，針對不同的治療方法可以優(yōu)化蛋白質(zhì)免疫、藥代動力學和藥代動力學，利用PEG與不同蛋白質(zhì)間的共價化合物在臨床研究中，聚乙二醇化可以顯著延長半衰期和凝血效果。雖然這一成熟的技術已在原則上證明了蛋白質(zhì)復合物的可行性，但仍存在一些局限性。PSA線性和均勻的聚苯乙烯是一種連接唾液的獨特碳水化合物;它具有很高的親水性、生物相容性和生物相容性。為了提高藥物的穩(wěn)定性和藥理作用，藥物的蛋白質(zhì)或肽表面以化合物的形式與唾液相關值相連，根據(jù)報道，聚氨酯改性是防止蛋白質(zhì)制劑降解的最佳方法，結果表明，SOD不僅能保持天然酶的高活性，而且能維持天然酶的高活性，而且在倫敦酸堿穩(wěn)定性方面具有優(yōu)于天然酶的優(yōu)勢，一個在格雷戈瑞大學的團隊使用聚氨酯作為糖鏈的來源。結果表明：改性蛋白在血液中的半衰期明顯延長，免疫原性和抗體降低，抗蛋白酶活性增強。干擾素的聚氨酯半衰期長。

4.3遺傳突變

隨著人類三級結構和結構領域的公布，隨著基因工程的迅速發(fā)展，F(xiàn)Ⅷ得到了迅速的發(fā)展。基因工程的目標是減少蛋白質(zhì)代謝。常用的技術包括轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)化、基因和蛋白質(zhì)去除。FⅧ通過限制腦酶的消化和活化而導致異源三聚體的不穩(wěn)定性，A2亞類可迅速降解，從而限制其活性延長FⅧ半衰期的可能性之一是FⅧ在體外比野生FⅧ具有更強的活性和穩(wěn)定性。FⅧ蛋白至少有三種LRP類型，分別位于A2、A3和C端。這些節(jié)點的突變會影響FⅧ與磷酸鹽、固定液和vWF的相互作用，從而延長FⅧ的半衰期。

4.4蛋白融合

FⅧ融合蛋白技術越來越受到人們的重視，該技術利用重組DNA從FⅧ或N端合成載體蛋白。最常見的蛋白質(zhì)載體是血清白蛋白和免疫球蛋白（IgG）Fc片段，人血清蛋白是血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，其分子量為-67kDa。廣泛分布于血管和血管外腔。它的半衰期長達19天，結構穩(wěn)定，作為血液和藥物中重要的物質(zhì)載體，已成為藥物設計的理想蛋白質(zhì)載體，以提高半衰期，減緩藥物的清除，增加藥物的作用，白蛋白已被證明是蛋白質(zhì)整合的載體，它能有效地延長各種蛋白質(zhì)的半衰期，包括胰島素、氨基酶等生物體的半衰期約為20天，其穩(wěn)定性是由于IgG的Fc片段能與新的Fc受體結合，阻止IgG在溶酶體中的分解。用Fc片段IgG與活性蛋白結合形成整合素，增加活性蛋白在體內(nèi)的半衰期，達到長期的目的。

5 ?結束語

既要重視藥物的有效性和安全性，又要提高患者的生活質(zhì)量。通過開發(fā)具有長半衰期的新蛋白質(zhì)來治療血友病。開發(fā)長期物理因子FⅧ具有很大的經(jīng)濟和社會優(yōu)勢，近年來的研究表明，一些方法取得了滿意的效果，但也存在一定的局限性，如何降低療效指標，減少免疫原材料，減少與其他蛋白質(zhì)的相互作用。進一步的研究將為新技術的發(fā)展提供更多的機會。深入了解FⅧ的結構和功能，一方面有助于從基因水平了解血友病患者的特點，另一方面本文介紹了FⅧ高純度產(chǎn)品的研制，為血友病A的診斷和治療提供了更有效的方法。隨著新技術的引進和各種色譜技術的應用，利用載體和色譜法，F(xiàn)VIII具有高純度和高利用率，基因工程在世界范圍內(nèi)得到了廣泛的應用，具有良好的應用前景和顯著的經(jīng)濟效益。

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