楊慧芬 毛娟娟

1 杭州市中醫(yī)院 浙江 杭州 310007

2 寧波市中醫(yī)院 浙江 寧波 315012

三陰性乳腺癌（TNBC）靶向及內(nèi)分泌治療效果不佳，新輔助化療方案對TNBC具有較高的緩解率和良好的預(yù)后，順鉑為首選化療藥物之一，但存在順鉑耐藥性，逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥性是有效治療TNBC的潛在策略。缺氧誘導(dǎo)因子l（HIF-1）可促進(jìn)腫瘤增殖和血管新生；HIF-1α功能性亞基與HIF-1活性水平密切相關(guān)。二至丸合桂枝湯可介導(dǎo)HIF-1α對TNBC細(xì)胞順鉑耐受機制進(jìn)行調(diào)控，但其機制仍未闡明。基于此，本研究利用HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染順鉑耐藥性MDA-MB-231（MDA-MB-231/CDDP）細(xì)胞株，深入探討二至丸合桂枝湯介導(dǎo)HIF-1通路對TNBC細(xì)胞系順鉑耐藥性的調(diào)控機制，以期為二至丸合桂枝湯的臨床推廣應(yīng)用提供堅實的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細(xì)胞：健康SPF級SD大鼠，體質(zhì)量200±30g[購于上海斯萊克動物實驗有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2017-0015]，飼養(yǎng)于杭州鷹旸生物科技有限公司動物中心，動物使用SYXK許可證號為(浙)2020-0024。適應(yīng)喂養(yǎng)1周。轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231(貨號：iCell-h133，賽百慷)，于含青霉素(100U/ml)、鏈霉素(100μg/ml)、5%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于恒溫培養(yǎng)箱中(37°C，含5%CO2)。

1.2 實驗試劑與儀器：二至丸合桂枝湯(女貞子、旱蓮草各10g，桂枝、芍藥、生姜各9g，炙甘草6g，大棗12枚，水煎至300ml，濃縮至1g/ml)。FBS(貨號：11011-8615，浙江天杭生物科技)；DMEM高糖培養(yǎng)基(貨號：SH30243.01，Hyclone)；CCK-8試劑盒(貨號：HY-K0301，MCE)；細(xì)胞凋亡試劑盒(貨號：556547，BD)；BCA蛋白定量試劑盒(貨號：pc0020，Solarbio)。HIF-1α、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、GAPDH抗體(貨號：AF1009、AF5131、AF7021，Affinity)。CMaxPlus酶標(biāo)儀(MD)；Micro17R低溫高速離心機(Thermo)；C6流式細(xì)胞儀(BD)；LightCycler?96實時熒光定量PCR(羅氏)；Nanodrop one mRNA定量儀(Thermo Scientific)。

1.3 HIF-1αsiRNA設(shè)計、轉(zhuǎn)染與分組：合成三條Gankyrin siRNA和一條對照siRNA，具體序列如下：1#siRNA 組(5'-GCUGGAGACACAAUCAUAUTT-3’)；2#siRNA組(5'-AGGAAGAACTATGAACATA AA-3')；3#siRNA組(5'-TACGTTGTGAGTGGTATTATT-3')；陰性對照組(5'-UUCUCCGA ACGUGUCACGUTT-3')。將 HIF-1α siRNA和 Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑在OptiMEM介質(zhì)中按照siRNA∶聚合物為1∶1(w/w)制備復(fù)合物。在50nM siRNA濃度下向細(xì)胞中加入配合物；細(xì)胞在50%～60%融合時轉(zhuǎn)染siRNA復(fù)合物。同時設(shè)置Control組，不做處理。

1.4 MDA-MB-231/CDDP細(xì)胞株建立：順鉑連續(xù)誘導(dǎo)法篩選耐藥細(xì)胞株。MDA-MB-231細(xì)胞系取對數(shù)生長期接種于DMEM培養(yǎng)液(含順鉑+10%FBS)，0.01、0.1、0.5、1、5、10μmol/L的順鉑逐漸誘導(dǎo)，48h后換培養(yǎng)液，每2～3d傳代1次，誘導(dǎo)6個月獲得細(xì)胞株。

1.5 制備二至丸合桂枝湯血清：20只SD大鼠隨機分為兩組，正常組：蒸餾水；給藥組：8.5g·kg-1·d-1二至丸合桂枝湯，灌胃7d。腹主動脈收集5ml血標(biāo)本，合并清液，滅活。微孔濾膜濾過，于－80℃冰箱保存。

1.6 給藥處理實驗分組：MDA-MB-231/CDDP細(xì)胞株在10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞隨機分為A：空白組(轉(zhuǎn)染siRNA陰性對照)、B：HIF-1α siRNA組、C：HIF-1αsiRNA+二至丸合桂枝湯(200μg/ml含藥血清)組、D：HIF-1αsiRNA+二至丸合桂枝湯(200μg/ml)+順鉑(10μmol/L)組，培養(yǎng)48h。

1.7 Western blot：分離目標(biāo)蛋白，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，先后加一抗和二抗孵育，免疫印跡反應(yīng)結(jié)束后，化學(xué)發(fā)光儀顯影。

1.8 CCK-8檢測：根據(jù)“1.6”細(xì)胞分組，培養(yǎng)對數(shù)生長期細(xì)胞懸液，加入10μl/孔CCK-8試劑，而后于450nm處測定吸光度值，計算細(xì)胞活性。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)：于6孔板接種對數(shù)生長期細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)至1×106/ml。添加500μl結(jié)合緩沖液，上清液離心并添加100μl結(jié)合緩沖液。之后分別加入5μl和10μlPI的膜Annexin V-FITC。室溫下反應(yīng)15min，加入400μl結(jié)合緩沖液，1h內(nèi)檢測細(xì)胞凋亡率。重復(fù)3次。

1.10 Transwell細(xì)胞侵襲：將5×104個細(xì)胞接種在Transwell上部隔室的無血清培養(yǎng)基中，并在下部隔室中添加含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。24h后棉簽擦拭基質(zhì)膠和上部隔室的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定10min，PBS洗3次，0.1%結(jié)晶紫染色30min。倒置顯微鏡觀察。重復(fù)3次。

1.11 qRT-PCR檢測：按試劑盒操作說明，加Trizol提取各組細(xì)胞總mRNA，mRNA質(zhì)量檢測完畢后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，cDNA為模板，特異性擴增VEGF、HIF-1α，GAPDH為內(nèi)參。VEGF及HIF-1α mRNA表達(dá)量應(yīng)采用2-△△Ct方法計算。各引物序列見表1。

表1 各引物序列

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α蛋白表達(dá)在不同siRNA下的影響：利用Western blot篩選合適的HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染用于后續(xù)實驗。由圖1，在MDA-MB-231細(xì)胞中，相比Control組，2#、3#siRNA組的HIF-1α蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.01)，且3#siRNA抑制效果比2#siRNA更好，因此后續(xù)實驗選擇3#siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

圖1 不同siRNA對MDA-MB-231細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)情況

2.2 MDA-MB-231/CDDP細(xì)胞活性在二至丸合桂枝湯聯(lián)合用藥下的影響：由圖2，作用24h、48h后，與A組相比，C組和D組細(xì)胞活性均顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)。

圖2 MDA-MB-231細(xì)胞活性變化情況（±s，n=6)

2.3 二至丸合桂枝湯聯(lián)合用藥對MDA-MB-231/CDDP細(xì)胞凋亡的影響：由圖3，與A組相比，各組別細(xì)胞凋亡率均有一定程度的升高，其中，D組促進(jìn)細(xì)胞凋亡效果最好，凋亡率最高。

圖3 各組細(xì)胞凋亡情況(±s，n=3)

2.4 二至丸合桂枝湯聯(lián)合用藥對MDA-MB-231/CDDP細(xì)胞侵襲能力的影響：由圖4，各給藥組不同程度地抑制細(xì)胞侵襲。與A組相比，細(xì)胞侵襲能力顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)的是C和D組MDA-MB-231/CDDP，且D組抑制細(xì)胞侵襲能力最顯著。

圖4 MDA-MB-231/CDDP細(xì)胞侵襲能力變化情況(200倍，±s，n=3)

2.5 MDA-MB-231/CDDP細(xì)胞中VEGF、HIF-1α mRNA及蛋白表達(dá)在二至丸合桂枝湯聯(lián)合用藥下的影響：由圖5可知，與A組相比，VEGF、HIF-1α mRNA表達(dá)均顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，在各干預(yù)組MDA-MB-231/CDDP細(xì)胞中，C組、D組細(xì)胞中HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，其中，降低程度最明顯的是D組細(xì)胞中HIF-1α、VEGF mRNA及蛋白表達(dá)。

圖5 a：MDA-MB-231/CDDP細(xì)胞中HIF-1α和VEGF的mRNA表達(dá)；b：MDA-MB-231/CDDP細(xì)胞中HIF-1α和VEGF的表達(dá)

3 討論

TNBC在中醫(yī)學(xué)屬“奶巖”“乳巖”等范疇，病位在乳房，病根在肝腎，治療的關(guān)鍵在于補腎益肝、調(diào)理陰陽。臨床研究發(fā)現(xiàn)，二至丸合桂枝湯可通過上調(diào)5-羥色胺、抑制素B水平，有效改善絕經(jīng)前Luminal型乳腺癌患者的臨床癥狀[1]。研究表明，HIF-1α siRNA通過Western blot篩選而來，從結(jié)果得出，受到明顯抑制的是位于3#siRNA組MDA-MB-231細(xì)胞中的HIF-1α蛋白表達(dá)，故選用3#siRNA組HIF-1αsiRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染。CCK-8檢測結(jié)果作用24h、48h后，D組可顯著抑制細(xì)胞活性且效果最好，提示二至丸合桂枝湯聯(lián)合順鉑可有效抑制MDA-MB-231/CDDP細(xì)胞活性，有效改善MDA-MB-231/CDDP細(xì)胞的耐藥性。

HIF-1可調(diào)節(jié)氧代謝，HIF-1α在多種腫瘤中表達(dá)高[2]。乳腺癌細(xì)胞耐藥形成過程中HIF-1α意義特殊，利用HIF抑制劑共同給藥可逆轉(zhuǎn)耐藥。此外，VEGF在多種腫瘤疾病中作用顯著，可促進(jìn)腫瘤血管新生和癌細(xì)胞增殖[3]。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF受HIF-1α調(diào)控，可促進(jìn)VEGF表達(dá)，提高腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧微環(huán)境，進(jìn)而利于癌細(xì)胞的生長浸潤與遷移[4]。研究指出[5]，通過抑制HIF-1α/VEGF信號傳導(dǎo)途徑，可提高多西他賽的化學(xué)敏感性，抵抗轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌的進(jìn)程。各干預(yù)組均可在一定程度上降低MDA-MB-231/CDDP細(xì)胞中VEGF、HIF-1a mRNA及蛋白表達(dá)，且D組降低程度最顯著，證實二至丸合桂枝可介導(dǎo)HIF-1α通路，下調(diào)VEGF表達(dá)，逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥性，加大順鉑對TNBC的治療效果。

HIF-1α還可活化促凋亡分子，拮抗抑凋亡分子，參與細(xì)胞凋亡[6]。研究結(jié)果證實，介導(dǎo)HIF-1α途徑抑制VEGF表達(dá)量，可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡。各干預(yù)組均可上調(diào)MDA-MB-231/CDDP細(xì)胞凋亡率，而HIF-1α siRNA+二至丸合桂枝湯+順鉑組凋亡率最高，證實二至丸合桂枝湯可增加MDA-MB-231/CDDP細(xì)胞對順鉑的敏感度，通過抑制HIF-1α表達(dá)，然后加快細(xì)胞凋亡。

綜上，二至丸合桂枝湯可通過抑制HIF-1α通路，下調(diào)VEGF表達(dá)，調(diào)控TNBC細(xì)胞系的順鉑耐藥性。