楊馥毓，丁小強(qiáng)，田 芳，方 舟，羅舜菁，劉成梅，熊 勇,*

1.南昌大學(xué) 食品學(xué)院 (南昌 330047)2.江西丹霞生物科技股份有限公司 (鷹潭 335200)

葉綠素是一種安全且具有一定生理功能的天然色素?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，葉綠素不僅可以在食品或化妝品中用作天然著色劑，而且還有重要的生理活性，如抗致突變、降解膽固醇和改善便秘等作用[1]。除此之外，由于葉綠素的分子結(jié)構(gòu)和人體血紅蛋白的分子結(jié)構(gòu)極其相似，區(qū)別僅在于兩者的中心離子不同，所以，葉綠素也被應(yīng)用于治療貧血癥[2]；另外，葉綠素也能夠提高正常紅細(xì)胞的生長，增加機(jī)體含氧量，促進(jìn)細(xì)胞分裂，從而有助于人體的新陳代謝[3]。但是，葉綠素不溶于水，在光照和一定的溫度條件下極易發(fā)生分解，從而其應(yīng)用受到局限。研究表明，通過使用銅、鐵、鋅等金屬離子置換葉綠素中心鎂離子生成的產(chǎn)物比葉綠素的穩(wěn)定性和水溶性更強(qiáng)，而且仍具有與葉綠素類似的色澤和生理功能，因此有大量關(guān)于葉綠素衍生物的相關(guān)研究，其中采用銅離子置換鎂離子生成葉綠素銅鈉鹽是最廣泛采用的方法[2]。

本文概述了葉綠素銅鈉鹽的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，重點(diǎn)總結(jié)了葉綠素銅鈉鹽的制備工藝，并提出了其中存在的問題與可能的改進(jìn)方法，為其進(jìn)一步研究和相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 葉綠素銅鈉鹽的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)

1.1 葉綠素銅鈉鹽的結(jié)構(gòu)

葉綠素銅鈉鹽的分子式為C34H31O6N4CuNa3和C34H30O5N4CuNa2，相對分子質(zhì)量約為724.17和684.16。葉綠素銅鈉鹽是利用葉綠素為基礎(chǔ)通過一系列反應(yīng)制備而成的產(chǎn)物。葉綠素是包含四個(gè)吡咯環(huán)，相互之間以甲烯基(=C-)聯(lián)結(jié)，從而形成穩(wěn)定的共軛體系，共軛體系中心結(jié)合著一個(gè)鎂離子，在共軛體系的側(cè)鏈上連接著兩個(gè)酯化的羧基基團(tuán)，分別是與甲醇、植醇所酯化[4]。葉綠素銅鈉鹽是在葉綠素的基礎(chǔ)上，發(fā)生皂化反應(yīng)脫去植醇和甲醇，且在酸性條件下，Cu2+取代Mg2+而生成的產(chǎn)物，葉綠素及葉綠素銅鈉鹽的分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。

1.2 葉綠素銅鈉鹽的性質(zhì)

葉綠素銅鈉鹽易溶于水，微溶于醇類，不溶于油脂和石油醚。其色澤為墨綠色，狀態(tài)為粉末狀。其水溶液為透明的藍(lán)綠色。若有Ca2+存在，則有沉淀析出。通過紫外可見光譜掃描可知，在405 nm±3 nm和630 nm±3 nm的兩個(gè)波長范圍內(nèi)均有最大吸收峰。

2 葉綠素銅鈉鹽的功能應(yīng)用

2.1 食品應(yīng)用

葉綠素銅鈉鹽被批準(zhǔn)可在果凍、蔬菜罐頭、糖果、飲料、果蔬汁類飲料、焙烤食品、配制酒、等產(chǎn)品中使用[5]。

2.2 醫(yī)療應(yīng)用

通過研究發(fā)現(xiàn)葉綠素銅鈉鹽有保護(hù)和促進(jìn)肝臟的功效，還能夠治療黃疸等疾病[6]；而且葉綠素銅鈉鹽能夠增強(qiáng)造血功能，促進(jìn)血紅蛋白的生成，治療貧血等癥狀[7]；葉綠素銅鈉鹽具有調(diào)節(jié)口腔微生物，防治蛀牙、牙周炎，消除口腔和呼吸道異味的作用[8]。另外，葉綠素銅鈉鹽還被用于濕疹、凍瘡、急性胰腺炎等病癥的治療[9]。

2.3 染色應(yīng)用

葉綠素銅鈉鹽能夠用于染色，是一種環(huán)保、節(jié)能的染料。利用其進(jìn)行染色，不但能夠充分利用生物質(zhì)資源，還符合當(dāng)前人們追求生態(tài)環(huán)保的理念。王娜，楊瑞玲等[10-11]通過研究發(fā)現(xiàn)，葉綠素銅鈉鹽染料適合在酸性條件下染羊毛、蠶絲和錦綸，這些材質(zhì)經(jīng)過葉綠素銅鈉鹽染色之后的色牢度也可以達(dá)到3級以上。

2.4 其他應(yīng)用

Ruan[12]通過研究發(fā)現(xiàn)，以葉綠素銅鈉鹽為電極的全固態(tài)超級電容器具有良好的彎曲能力和柔韌性。這也表明葉綠素銅鈉鹽在全固態(tài)超級電容器方面具有潛在的應(yīng)用。

3 葉綠素銅鈉鹽的制備工藝研究

葉綠素銅鈉鹽的制備包括：葉綠素的提取，利用葉綠素制備葉綠素銅鈉鹽。

3.1 葉綠素提取

研究表明，提取葉綠素的方法主要包括溶劑提取法、超聲波輔助提取法、超臨界流體萃取法等方法[13]。其中最常用的方法是溶劑提取法。該方法是依據(jù)相似相溶的原理，提取溶劑和被提取物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)越相似，被提取物在溶劑中的溶解能力就越大，就越容易被提取出來。葉綠素含有一個(gè)親水性的卟啉基團(tuán)和一個(gè)親脂性的葉綠醇的結(jié)構(gòu)[13]。親脂性的葉綠醇具有20個(gè)碳原子，較長的碳鏈決定了其極性較小，親脂性較強(qiáng)而親水性較弱，相反親水性的卟啉結(jié)構(gòu)增強(qiáng)了其極性。因此，提取葉綠素最佳的溶劑是中等極性的有機(jī)溶劑，例如丙酮、乙醇、乙醚等。常見的溶劑的極性如下表1所示。

表1 某些溶劑的介電常數(shù)

楊軍[14]通過實(shí)驗(yàn)對比了100%無水乙醇、100%丙酮等十幾種溶劑對葉綠素提取率的影響，結(jié)果為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的丙酮-無水乙醇(1∶2，v/v)復(fù)配為最佳提取溶劑。復(fù)配的溶劑比單一溶劑的提取效果更好，可以認(rèn)為是一種協(xié)同萃取效應(yīng)，也可以認(rèn)為復(fù)配溶劑的性質(zhì)與被提取物更加相似，因而提取率更高。雖然采用丙酮與其他溶劑的復(fù)配液具有較高的葉綠素提取率。但是，丙酮的閃點(diǎn)低、易爆、揮發(fā)性較強(qiáng)，在大規(guī)模的工業(yè)化使用中具有一定的危險(xiǎn)性。因此采用安全性高、低毒的試劑替代丙酮作為葉綠素的提取溶劑是必要的。乙醇揮發(fā)性低、毒性低且安全性高，而且對于葉綠素有較高的提取率，因此成為工業(yè)化提取葉綠素的最佳試劑。

葉綠素位于葉綠體片層的蛋白質(zhì)和脂脂中間，其中親水性的卟啉基團(tuán)連接蛋白質(zhì)，親脂性的葉綠醇連接脂質(zhì)層。提取葉綠素時(shí)適當(dāng)加入少量的水有利于葉綠素親水性基團(tuán)和蛋白質(zhì)的分離，從而促進(jìn)葉綠素的提取。房家詳[15]通過研究發(fā)現(xiàn)，乙醇與水濃度比為4∶1時(shí)，葉綠素的提取率最大——12.8 g/kg，使用100%乙醇提取葉綠素時(shí)，提取率反而減少。

超臨界流體萃取技術(shù)作為新型分離技術(shù)，其操作溫度低、分離效率高且溶劑回收率高，近年來開始應(yīng)用于植物和中草藥有效成分的提取。Lefebvre[16]通過研究發(fā)現(xiàn)，通過超臨界流體萃取的方法，在二氧化碳中添加30%的極性改性劑能夠獲得葉綠素。

超聲輔助萃取技術(shù)也經(jīng)常被應(yīng)用于分離提取中，超聲波的振動(dòng)空化作用能夠促進(jìn)細(xì)胞的裂解，從而有利于溶劑的提取，Choi[17]通過研究表明，利用超聲波輔助提取葉綠素的提取率比有機(jī)溶劑提取法更高。

3.2 葉綠素銅鈉鹽的制備

葉綠素銅鈉鹽的制備，包括皂化、酸化、銅代以及成鹽四個(gè)反應(yīng)步驟。另外，由于原料中的葉綠素含量極少，提取之后會(huì)含有很多雜質(zhì)，因此除了這些必要的反應(yīng)步驟還會(huì)加入純化除雜的步驟。事實(shí)上，現(xiàn)有的工藝存在一定的弊端，例如皂化不完全、銅代“失綠”，以及純化效果差、產(chǎn)品質(zhì)量低等，因此有待進(jìn)一步改進(jìn)。

3.2.1葉綠素銅鈉鹽制備原理

(1)皂化

葉綠素分子上的兩個(gè)酯基和氫氧化鈉發(fā)生皂化反應(yīng)，脫去植醇和甲醇，生成水溶性的葉綠素鈉鹽(以葉綠素a為例，見圖2)。

圖2 皂化反應(yīng)的反應(yīng)方程式

(2)酸化

在酸性環(huán)境中，氫離子取代葉綠素鈉鹽中的鎂離子和鈉離子，生成葉綠酸及硫酸鎂和硫酸鈉(見圖3)。

圖3 酸化反應(yīng)的反應(yīng)方程式

(3)銅代

在酸性介質(zhì)中，加入一定量的CuSO4溶液，葉綠酸分子中的氫離子會(huì)被銅離子取代生成墨綠色的葉綠素銅酸(見圖4)。

圖4 銅代反應(yīng)的反應(yīng)方程式

(4)成鹽

將葉綠素銅酸溶解，與氫氧化鈉溶液反應(yīng)，可得到水溶性葉綠素銅鈉鹽(見圖5)。

圖5 成鹽反應(yīng)的反應(yīng)方程式

3.2.2制備工藝存在的問題及改進(jìn)

葉綠素的皂化程度不僅會(huì)影響銅代反應(yīng)的進(jìn)行，而且也會(huì)影響葉綠素銅鈉鹽的產(chǎn)量、色澤和質(zhì)地。有研究通過探究pH值對皂化反應(yīng)的影響，得出pH=11或12時(shí)是最佳皂化條件[3, 18-21]。但是目前市場上大多數(shù)pH計(jì)和pH試紙只適合在水溶液中使用，而葉綠素的提取溶劑為高濃度的乙醇、丙酮等有機(jī)試劑，在此條件下測得pH值存在一定的偏差且不穩(wěn)定。因此皂化反應(yīng)要根據(jù)NaOH的實(shí)際添加量進(jìn)行探究，而不能僅依據(jù)pH值。葉綠素為脂溶性物質(zhì)，皂化前可以溶解于石油醚，皂化后生成水溶性的葉綠素鈉鹽不溶于石油醚，因此，皂化反應(yīng)之后在其中加入石油醚進(jìn)行萃取，通過分層情況與石油醚層狀態(tài)也可以預(yù)判皂化反應(yīng)是否完全。萃取相和萃余相兩相分層清晰且石油醚層呈黃色可判斷反應(yīng)較完全[21]。

對葉綠素銅鈉鹽進(jìn)行酸化銅代時(shí)，很多研究在葉綠素鈉鹽水溶液中加入一定濃度的硫酸溶液從而將pH調(diào)到2.5左右，反應(yīng)一定的時(shí)間后加入硫酸銅溶液[22-24]。事實(shí)上，直接將pH調(diào)為2.5可能會(huì)破壞葉綠素鈉鹽的卟啉結(jié)構(gòu)，從而使得生成的葉綠素銅酸失綠，進(jìn)而影響葉綠素銅鈉鹽的品質(zhì)。酸化目的是為了更好、更方便地進(jìn)行銅代，同時(shí)酸化也是為了避免硫酸銅與氫氧化鈉發(fā)生反應(yīng)，生成氫氧化銅等其他物質(zhì)。因此，酸化銅代時(shí)先將pH調(diào)為中性，加入適量硫酸銅進(jìn)行反應(yīng)，然后再將溶液調(diào)為2.5，這樣能夠避免太強(qiáng)的酸性環(huán)境可能會(huì)造成葉綠素鈉鹽中卟啉結(jié)構(gòu)的破壞。

由于葉綠素在原料中含量極少，提取之后的雜質(zhì)相對較多，因此純化步驟是必要的。在葉綠素銅鈉鹽的制備過程中，皂化反應(yīng)生成葉綠素鈉鹽后加入石油醚進(jìn)行溶劑萃取，目的是除去脂肪、胡蘿卜素、葉黃素和植物醇等脂溶性物質(zhì)，是為了獲得較高的產(chǎn)品品質(zhì)[25]。溶劑萃取時(shí)，各成分在兩相溶劑中分配系數(shù)相差越大，其分離效果越好，雜質(zhì)去除率越高。傳統(tǒng)工藝是在乙醇中進(jìn)行皂化反應(yīng)生成葉綠素鈉鹽，再利用石油醚萃取除雜。事實(shí)上，利用乙醇-石油醚兩相進(jìn)行溶劑萃取的效果較差，這是因?yàn)椴糠钟H脂性雜質(zhì)在乙醇中的溶解度也較大，從而使得除雜效果不理想。如果將乙醇回收，葉綠素鈉鹽只是溶于水，水與石油醚的極性相差較大，從而能夠獲得更好的除雜效果。除此之外，單一溶劑進(jìn)行多次萃取只能除去少量在該溶劑中溶解度較高的雜質(zhì)。而采用不同極性的多種試劑進(jìn)行萃取能夠?qū)⒍喾N雜質(zhì)萃取分離出來，從而增強(qiáng)其除雜效果。因此選用3～4種不同極性溶劑如乙酸乙酯、丁醇、氯仿、石油醚進(jìn)行溶劑萃取，由低極性到高極性將葉綠素鈉鹽水溶液分步進(jìn)行萃取，除去極性不同的雜質(zhì)。

除此之外，在銅代反應(yīng)生成葉綠素銅酸后使用水、低濃度醇、石油醚等進(jìn)行洗滌除雜，使用水洗滌能夠除去過量的鈉離子、銅離子等水溶性雜質(zhì)，使用低濃度醇洗滌能夠去除未被皂化的極性物質(zhì)，使用石油醚洗滌除去脂溶性雜質(zhì)，最終將葉綠素銅酸粗品洗滌成墨綠色帶有金屬光澤疏松顆粒狀精品。這些步驟也是為了純化除雜，獲得較高的產(chǎn)品品質(zhì)。

4 總結(jié)與展望

當(dāng)前，由于食品安全意識的增強(qiáng)，許多合成色素被禁止使用，安全、天然的產(chǎn)品更加受到人們的青睞，從而為天然色素市場開發(fā)提供了良好機(jī)遇，天然食用色素逐漸成為朝陽產(chǎn)業(yè)。葉綠素銅鈉鹽作為安全的天然色素，不僅可以作為著色劑添加到食品中，而且在醫(yī)藥方面具有良好的效果與應(yīng)用。但是由于原料中的葉綠素含量很低，提取之后有較多的雜質(zhì)，再加上現(xiàn)有制備工藝中存在一定的缺陷，從而導(dǎo)致市場上售賣的葉綠素銅鈉鹽產(chǎn)品大多品質(zhì)較低，因此亟需從不同角度入手改善葉綠素銅鈉鹽的制備工藝和提純方法。