饒家瑞， 張 欣， 余用秀

(1.貴州省茶葉研究所， 貴州 貴陽 550006； 2.貴州省生物技術(shù)研究所， 貴州 貴陽 550006)

中國(guó)是茶葉生產(chǎn)第一大國(guó)，也是茶葉出口第二大國(guó)，但近年隨著國(guó)外對(duì)茶葉進(jìn)口農(nóng)藥最大殘留限定標(biāo)準(zhǔn)的提高，致使每年損失數(shù)億美元[1]；在農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)中絕大部分是化學(xué)農(nóng)藥[2]。因此，為使茶葉農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)符合最大殘留限定、減少茶葉病害防控中化學(xué)農(nóng)藥的施用，利用植物次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行茶葉病害防控，保障茶葉綠色安全生產(chǎn)具有重要的意義。植物中蘊(yùn)含的天然產(chǎn)物種類繁多[3]，而生姜作為常見的烹飪調(diào)料植物，富含酚類、萜類、生物堿類和黃酮類等眾多植物次生代謝產(chǎn)物，具有增強(qiáng)免疫力、抗氧化和抑菌等生物活性[4-5]。有研究表明，生姜精油對(duì)病菌有一定的抑制作用，如對(duì)枯草芽孢桿菌、表皮葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)分別為2.3 μg/mL和4.6 μg/mL、9.2 μg/mL和18.4 μg/mL[6]；對(duì)腐皮鐮刀菌、油菜菌核病菌和立枯絲核菌的IC50分別為396.39 mg/L、439.73 mg/L和146.83 mg/L[7]；10-姜酚對(duì)乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞用藥72 h后表現(xiàn)出最佳的抑制作用，其IC50分別為25.80 μmol/L和35.29 μmol/L[8]；生姜提取物∶檸檬酸=1.22∶1對(duì)金黃色葡萄球菌和啤酒酵母的抑菌活性分別為15 mg/mL和8 mg/mL[9]。為篩選出對(duì)茶樹茶輪斑病病害防控有效的植物源農(nóng)藥，減少茶園化學(xué)農(nóng)藥施用量，實(shí)現(xiàn)茶葉綠色環(huán)保安全生產(chǎn)，筆者采用有機(jī)溶劑浸提和超聲波輔助方法[10-11]，提取生姜中蘊(yùn)含的天然產(chǎn)物，并利用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)試生姜提取天然產(chǎn)物對(duì)茶輪斑病病原菌(Pestalotiopsistrachicarpicola)的室內(nèi)毒力強(qiáng)度，以期利用生姜天然提取物防治茶輪斑病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 茶輪斑病病原菌 病原菌為2020年7月張欣等[12]從貴州省銅仁市石阡縣采集，經(jīng)分離、形態(tài)學(xué)鑒定、DNA比對(duì)和致病性鑒定為茶輪斑病病原菌(Pestalotiopsistrachicarpicola)，由貴州省生物技術(shù)研究所提供。

1.1.2 藥劑 二氯甲烷、乙酸乙酯，購(gòu)于天津市富宇精細(xì)化工有限公司；甲醇，購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；乙醇，購(gòu)于天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；土豆培養(yǎng)基(PDA)，購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；二甲基亞砜，購(gòu)于上海阿拉丁生化股份有限公司；吐溫80，購(gòu)于天津市大茂化學(xué)試劑廠；其他試劑，購(gòu)于上海安耐吉化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器 德意生超聲波清洗機(jī)(深圳市華策科技有限公司)，超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司)，電子天平(型號(hào)：BSA224S-CW)，恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，高溫蒸汽滅菌鍋(上海沉匯儀器有限公司)，研缽80 mm(河北鼎盛隆華實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)IKA)，BHC-1300II A/B3生物潔凈安全柜，Mill-Q型超純水制備儀，20～200 μL、100～1 000 μL和1～5 mL移液槍等。

1.2 方法

1.2.1 生姜天然產(chǎn)物提取 將凱里生姜去皮洗凈，分別在電子天平上稱量30 g，共4組。將每組生姜切成小塊放入研缽中反復(fù)研磨，參照有機(jī)溶劑浸提法[10]和超聲波輔助提取法[11]，分別在4組研磨后的生姜中加入二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇，置于超聲波清洗儀中以30℃超聲10 min。用濾紙過濾提取液，再將過濾液分別裝入100 mL圓底燒瓶中旋轉(zhuǎn)蒸餾除去溶劑，得到生姜提取天然產(chǎn)物。

1.2.2 提取天然產(chǎn)物的抑菌活性試驗(yàn)

1) 培養(yǎng)基配制。將3 L超凈水注入5 L燒杯中，加入土豆培養(yǎng)基120 g、瓊脂 40 g，并用玻璃棒攪拌均勻。在攪拌狀態(tài)下將配置的培養(yǎng)基以每瓶45 mL倒入100 mL錐形瓶中并封口，在121℃條件下高壓滅菌20 min，冷卻后備用。

2) 藥液配制。按1 mg天然產(chǎn)物使用20 μL二甲基亞砜溶解的比例，將提取的天然產(chǎn)物配成溶液置于2 mL離心管中備用[處理1：二氯甲烷提取天然產(chǎn)物；處理2：乙酸乙酯提取天然產(chǎn)物；處理3：甲醇提取天然產(chǎn)物；處理4：乙醇提取天然產(chǎn)物；處理5(CK1)：陽性對(duì)照藥劑春雷霉素；處理6(CK2)：空白對(duì)照，等量滅菌吐溫水]。在紫外滅菌30 min以上的超凈工作臺(tái)上，將200 μL吐溫80加入200 mL滅菌水中攪拌均勻，按照每種天然產(chǎn)物5個(gè)濃度梯度對(duì)應(yīng)5只10 mL離心管進(jìn)行配藥。每只10 mL離心管中依次加入0.8 mL吐溫水、200 μL對(duì)應(yīng)天然產(chǎn)物配置液和4 mL吐溫水。將配置好的5 mL藥液倒入PDA培養(yǎng)基中混勻(使50 mL含藥液培養(yǎng)基的最終濃度為200 μg/mL)，再平均倒入3個(gè)培養(yǎng)皿中冷卻備用。

3) 真菌接種。提前用75%酒精擦拭超凈工作臺(tái)消毒，打開紫外燈30 min以上。將提前活化好的茶輪斑病病原菌(Pestalotiopsistrachicarpicola)置于消毒后的超凈工作臺(tái)上，用打孔器在其邊緣打孔并制成直徑為4.0 mm的菌餅。再用無菌接種針將菌餅移置到含有藥液的培養(yǎng)皿中央，每處理重復(fù)3次。最后，將接種后的培養(yǎng)皿置于25℃、80%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。待空白對(duì)照組菌絲長(zhǎng)至6.0 cm左右時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量生長(zhǎng)菌絲的菌餅直徑，并計(jì)算抑制率(I)。

I=[(C-T)/(C-0.4)]×100%

式中，C為空白對(duì)照菌餅直徑，T為藥物處理菌餅直徑。

1.2.3 提取天然產(chǎn)物抗茶輪斑病的毒力測(cè)定 根據(jù)生姜提取天然產(chǎn)物在200 μg/mL濃度下對(duì)茶輪斑病的初篩抑制率，選擇處理1的濃度梯度為400 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL和25 μg/mL；處理2的濃度梯度為200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL和12.5 μg/mL；處理3和處理4的濃度梯度為1 600 μg/mL、800 μg/mL、400 μg/mL、200 μg/mL和100 μg/mL，進(jìn)行4組天然產(chǎn)物的EC50測(cè)定。另設(shè)陽性對(duì)照組處理5(CK1，藥物為春雷霉素)、空白對(duì)照組處理6(CK2，等量滅菌吐溫水)。每處理重復(fù)3次。利用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定生姜提取天然產(chǎn)物的抑菌活性，采用十字交叉法測(cè)量生長(zhǎng)菌絲的菌餅直徑，并計(jì)算抑制率，取濃度對(duì)數(shù)與抑制率做線性回歸方程，從而計(jì)算得出EC50。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2010和DPS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生姜提取天然產(chǎn)物的產(chǎn)率

從表1可知，生姜提取天然產(chǎn)物的產(chǎn)率依次為乙醇>甲醇>二氯甲烷>乙酸乙酯，其產(chǎn)率分別為4.13%、2.62%、0.71%和0.45%。甲醇和乙醇提取物質(zhì)以親水性的酚類、醛類和萜類等為主，二氯甲烷和乙酸乙酯提取物質(zhì)以親脂性的黃酮類、生物堿等為主。

表1 4種溶劑提取生姜天然產(chǎn)物的產(chǎn)率

2.2 不同處理茶輪斑病病原菌的抑制率

從表2可知，在200 μg/mL濃度下4種溶劑提取生姜天然產(chǎn)物對(duì)茶輪斑病病原菌的抑制率以處理2最高，為56.67%，較CK1高26.37百分點(diǎn)；處理1其次，為43.33%，較CK1高13.03百分點(diǎn)；處理1、處理2均與CK1間差異極顯著。處理3和處理4的抑制率分別為19.09%和12.73%，分別比CK1少11.21百分點(diǎn)他17.57百分點(diǎn)。說明，二氯甲烷和乙酸乙酯親脂性溶劑提取生姜天然產(chǎn)物的活性優(yōu)于甲醇和乙醇溶劑提取。

表2 不同處理茶輪斑病病原菌的抑制率

2.3 不同處理濃度茶輪斑病病原菌的抑制率與EC50

2.3.1 抑制率 從表3看出，在200 μg/mL和100 μg/mL濃度下，4種溶劑提取生姜天然產(chǎn)物對(duì)茶輪斑病病原菌的抑制率均以處理2最高，抑制率分別為57.44%和38.39%，分別比同濃度下的處理1、處理3、處理4高5.65百分點(diǎn)和2.08百分點(diǎn)、37.20百分點(diǎn)和30.35百分點(diǎn)、43.15百分點(diǎn)和33.93百分點(diǎn)。4種溶劑提取生姜天然產(chǎn)物對(duì)茶輪斑病病原菌的抑制率隨濃度下降而降低，且各濃度間差異均達(dá)極顯著。

表3 不同處理及濃度下茶輪斑病病原菌的抑制率

2.3.2EC50從表4可知，4種溶劑提取生姜天然產(chǎn)物對(duì)茶輪斑病的毒力方程的相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.95，表明4種溶劑提取生姜天然產(chǎn)物的濃度與抑制率間均存在良好的線性關(guān)系。處理1～處理4的EC50分別為179.89 μg/mL、150.46 μg/mL、713.24 μg/mL和742.60 μg/mL。其中，處理1、處理2的EC50分別比CK1減少用藥量190.58 μg/mL和220.01 μg/mL。說明，乙酸乙酯溶劑提取生姜天然產(chǎn)物的毒力強(qiáng)度最大，二氯甲烷溶劑其次，且兩者抗茶輪斑病的效果均優(yōu)于陽性對(duì)照藥劑春雷霉素。

表4 不同處理茶輪斑病病原菌的毒力回歸方程及EC50

3 結(jié)論

1) 用4種不同有機(jī)溶劑從凱里生姜中浸提天然產(chǎn)物的產(chǎn)率依次為乙醇>甲醇>二氯甲烷>乙酸乙酯，產(chǎn)率分別為4.13%、2.62%、0.71%和0.45%。

2) 抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果表明，在200 μg/mL濃度下，4種溶劑提取生姜天然產(chǎn)物對(duì)茶輪斑病病原菌的抑制率以乙酸乙酯溶劑最高，為56.67%，較對(duì)照藥劑春雷霉素增加26.37百分點(diǎn)；二氯甲烷溶劑其次，為43.33%，較對(duì)照藥劑春雷霉素增加13.03百分點(diǎn)；二氯甲烷溶劑和乙酸乙酯溶劑提取生姜天然產(chǎn)物對(duì)茶輪斑病的抑菌活性均極顯著高于對(duì)照藥劑春雷霉素。

3) 毒力強(qiáng)度試驗(yàn)結(jié)果表明，在不同濃度下，4種溶劑提取生姜天然產(chǎn)物對(duì)茶輪斑病病原菌的抑制率均隨濃度下降而降低，且各濃度間差異均達(dá)極顯著。二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇4種溶劑提取生姜天然產(chǎn)物的EC50分別為179.89 μg/mL、150.46 μg/mL、713.24 μg/mL和742.60 μg/mL，且二氯甲烷、乙酸乙酯溶劑提取生姜天然產(chǎn)物的EC50分別比對(duì)照藥劑春雷霉素的EC50(370.47 μg/mL)小190.58 μg/mL和220.01 μg/mL，即乙酸乙酯溶劑提取生姜天然產(chǎn)物的毒力強(qiáng)度最大，二氯甲烷溶劑其次，且兩者抗茶輪斑病的效果均優(yōu)于陽性對(duì)照藥劑春雷霉素。