饒家瑞， 張 欣， 余用秀

(1.貴州省茶葉研究所， 貴州 貴陽 550006； 2.貴州省生物技術研究所， 貴州 貴陽 550006)

瑞士科學家PAUL于1938年發(fā)現(xiàn)合成化合物雙對氯苯基三氯乙烷(DDT)具有殺蟲活性后，使得農藥進入了有機合成時代[1]。有機農藥具有活性高、見效快等特點，但自然降解慢、毒副作用較大和生態(tài)破壞力較強[2]。隨著人們對糧食安全生產問題的日益重視，研究對動植物及環(huán)境友好、安全的生物農藥成為解決上述問題的重要途徑之一[3]。植物產生的次生代謝產物超過40萬種[4]，是篩選抗菌活性化合物的天然寶庫。植物源農藥作為生物農藥的重要組成部分，因其可降解、無殘留和綠色安全的特點而受到重視。植物源農藥可通過微波法[5]、牛津杯法[6]、超聲波提取法[7]等提取植物有效成分，用于田間有關病害的綠色防治。研究表明，大蒜提取物對病原菌有一定的抑制作用，如大蒜素對伽師瓜貯藏過程中常致腐爛的毛霉菌、鐮飽菌、鏈格孢菌和青霉菌4種病原菌的最小抑菌濃度分別為2.3 g/L、1.7 g/L、2.2 g/L和2.6 g/L[8]；大蒜素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的平均半抑制濃度為(0.30±0.09)mg/mL[9]；大蒜素對真菌黑曲霉和繩狀青霉的最低抑制生長濃度均為0.063%，對細菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌最低抑制生長濃度均為0.125%[10]。

茶輪斑病(Pestalotiopsistrachicarpicola)是一種廣泛分布于世界各地茶園的茶樹茶葉病害，為茶輪斑病的綠色高效防控提供參考，以威寧紫皮大蒜為材料，二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇為溶劑，利用浸提法[11]提取威寧紫皮大蒜的天然產物，研究不同溶劑提取物對茶輪斑病病原菌的抑菌活性，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 茶輪斑病病原菌 該病菌由張欣等[12]2020年7月采集于銅仁市石阡縣茶園，經單孢分離、形態(tài)學鑒定和DNA測序等手段鑒定，病原菌為茶輪斑病(Pestalotiopsistrachicarpicola)，由貴州省生物技術研究所提供。

1.1.2 藥劑 二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇，購于天津市富宇精細化工有限公司；吐溫80，購于天津市大茂化學試劑廠；土豆培養(yǎng)基(PDA)，購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；其他試劑，購于上海安耐吉化學試劑有限公司。

1.1.3 儀器 超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)，電熱鼓風干燥箱(上海一恒科技有限公司)，電子天平(型號：BSA224S-CW)，恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)，高溫蒸汽滅菌鍋(上海沉匯儀器有限公司)，BHC-1300II A/B3生物潔凈安全柜，研缽80 mm(河北鼎盛隆華實驗儀器有限公司)，旋轉蒸發(fā)儀(德國IKA)，Mill-Q型超純水制備儀，20～200 μL、100～1 000 μL和1～5 mL移液槍等。

1.2 試驗方法

1.2.1 大蒜天然產物的提取 將威寧紫皮大蒜(購買于市場)去皮，在電子天平上分別稱量4組，每組30 g。將稱量好的大蒜切碎后分別放入4個研缽中反復研磨，參照浸提法[11]，遵循溶劑與天然產物的相似相容性，將溶劑二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇各30 mL分別加入4個研磨大蒜的研缽中，攪拌3 min后靜置10 min。用濾紙過濾提取液，將過濾液分別裝入100 mL圓底燒瓶中旋轉蒸餾去掉溶劑，得到提取天然產物。

1.2.2 提取天然產物的抑菌活性試驗

1) 培養(yǎng)基配制。按照購買的土豆培養(yǎng)基(PDA)配方，在2.5 L超純水中加入PDA 100 g和瓊脂32 g，攪拌均勻，然后在攪拌狀態(tài)下以每瓶45 mL倒入100 mL錐形瓶中并封口，121℃高壓滅菌 20 min，冷卻后備用。

2) 藥液配制。按1 mg天然產物加入20 μL二甲基亞砜的比例溶解后備用。稱量提取天然產物配置成溶液，即處理1(二氯甲烷提取大蒜天然產物)、處理2(乙酸乙酯提取大蒜天然產物)、處理3(甲醇提取天大蒜然產物)、處理4(乙醇提取大蒜天然產物)，另設陽性對照組處理5(CK1，藥物為春雷霉素)、空白對照組處理6(CK2，等量滅菌吐溫水)。在200 mL滅菌水中加入200 μL吐溫80，攪拌均勻，然后依次在10 mL離心管中加入0.8 mL吐溫水、200 μL對應天然產物配置液和4 mL吐溫水。將配置好的5 mL藥液倒入PDA培養(yǎng)基中混勻(使50 mL含藥液的培養(yǎng)基終濃度為200 μg/mL)，再平均倒入3個培養(yǎng)皿中冷卻備用。

3) 接種真菌。提前打開超凈工作臺紫外燈殺菌30 min以上，將提前活化好的茶輪斑病病原菌餅置于工作臺，用打孔器在其邊緣打孔，制成直徑為 4.0 mm的菌餅，再用無菌接種針將菌餅分別移動到含有藥液的培養(yǎng)基中央，每組重復3次。最后將接種的培養(yǎng)皿置于25℃、80%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。待空白對照組菌絲長至6.0 cm左右時，采用十字交叉法測量生長菌絲的菌餅直徑，并計算抑制率(I)。

I= [(C-T)/(C-0.4)]×100%

式中，C為空白對照菌餅直徑，T為藥物處理菌餅直徑。

1.2.3 提取天然產物抗茶輪斑病的毒力測定 根據(jù)提取天然產物在200 μg/mL濃度下的初篩抑制率，選擇處理1和處理2的濃度梯度為200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL和12.5 μg/mL，處理3和處理4的濃度梯度為1 600 μg/mL、800 μg/mL、400 μg/mL、200 μg/mL和100 μg/mL進行4組天然產物的EC50測定。另設陽性對照組處理5(CK1，藥物為春雷霉素)、空白對照組處理6(CK2，等量滅菌吐溫水)。利用菌絲生長速率法測定抑菌活性，采用十字交叉法測量生長菌絲的菌餅直徑，抑制率計算方法同上，濃度取對數(shù)與抑制率做線性回歸方程，從而計算得出EC50。

1.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2010和DPS軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 大蒜提取天然產物的產率

從表1看出，不同溶劑提取大蒜天然產物的產率為甲醇>乙醇>乙酸乙酯>二氯甲烷，其產率分別為3.19%、1.61%、0.15%和0.22%。說明，甲醇、乙醇提取到的大蒜天然產物比乙酸乙酯和二氯甲烷提取的高且天然產物以親水性為主。

表1 4種溶劑提取大蒜天然產物的產率

2.2 不同處理茶輪斑病病原菌的抑制率

從表2看出，4種溶劑提取大蒜天然產物200 μg/mL對茶輪斑病病原菌的抑制率以處理1最高，為95.10%，較CK1高64.55百分點；處理2其次，為91.64%，較CK1高61.09百分點；且處理1和處理2均極顯著高于CK1。處理3、處理4的抑制率分別為8.36%和15.27%，比CK1低22.19百分點和15.28百分點，且均極顯著低于CK1。說明，大蒜中以脂溶性為主的天然產物對茶輪斑病病原菌的抑菌活性優(yōu)于水溶性為主的天然產物。

表2 不同處理茶輪斑病病原菌的抑制率

2.3 不同處理濃度對茶輪斑病的毒力強度與EC50

從表3可知，對應菌落的生長直徑隨提取大蒜天然產物濃度下降而增大，抑制率均隨提取大蒜天然產物濃度的下降而降低，各濃度間差異均達極顯著。說明，抑制率與其對應提取大蒜天然產物的濃度均呈較好的線性關系，測定EC50的可信度高。二氯甲烷提取大蒜天然產物(處理1)12.5～200 μg/mL對茶輪班病的抑制率為24.78%～93.95%，比對照藥劑春雷霉素(CK1)800～50 μg/mL濃度的高27.67～11.24百分點；乙酸乙酯提取大蒜天然產物(處理2)的抑制率略低于處理1。乙醇提取大蒜天然產物(處理4)100～1 600 μg/mL對茶輪斑病病原菌的抑制率優(yōu)于甲醇提取大蒜天然產物(處理3)，處理3的抑制率低于CK1，處理4的抑制率略高于CK1。

2.4 不同處理對茶輪斑病的毒力強度

從表4可知，4種溶劑提取大蒜天然產物對茶輪斑病病原菌的毒力方程的相關系數(shù)(R2)均大于0.95，表明4種溶劑提取大蒜天然產物、對照藥劑春雷霉素的濃度與抑制率間均存在良好的線性關系。處理1和處理2的EC50分別為31.58 μg/mL和47.59 μg/mL，分別比春雷霉素(382.08 μg/mL)減少用藥量350.50 μg/mL和334.49 μg/mL；處理3和處理4的EC50分別為919.33 μg/mL和658.50 μg/mL，分別比春雷霉素增加用藥量537.25 μg/mL和276.42 μg/mL。說明，二氯甲烷和乙酸乙酯溶劑提取大蒜天然產物抗茶輪斑病的效果均優(yōu)于對照藥劑春雷霉素，并以二氯甲烷提取的毒力強度最大。

3 結論

1) 用二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇溶劑浸提威寧紫皮大蒜天然產物的產率分別為0.15%、0.22%、3.19%和1.61%，即不同溶劑提取的大蒜天然產物產率為甲醇>乙醇>乙酸乙酯>二氯甲烷。

2) 抑菌活性試驗結果表明，4種溶劑提取大蒜天然產物200 μg/mL對茶輪斑病病原菌的抑制率為二氯甲烷>乙酸乙酯>乙醇>甲醇，并以二氯甲烷和乙酸乙酯溶劑提取大蒜天然產物的抑制率較高，分別為95.10%和91.64%，比對照藥劑春雷霉素(30.55%)分別高64.55百分點和61.09百分點。在試驗濃度下4種溶劑提取大蒜天然產物對茶輪斑病病原菌的抑制率均隨濃度下降而降低，且各濃度間差異均達極顯著。

3) 毒力強度試驗結果表明，二氯甲烷和乙酸乙酯溶劑提取大蒜天然產物的EC50分別為31.58 μg/mL和47.59 μg/mL，分別比春雷霉素(382.08 μg/mL)減少用藥量350.50 μg/mL和334.49 μg/mL，即2種溶劑提取大蒜天然產物抗茶輪斑病效果均優(yōu)于對照藥劑春雷霉素，并以二氯甲烷溶劑提取大蒜天然產物的毒力強度最大。