宮莉莉 呂 智

廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院(福建 廈門 361000)

肺癌在世界范圍內(nèi)發(fā)病率較高,是最致命的惡性腫瘤之一,5年生存率約為15%,每年約有160萬人死于肺癌[1]。在我國,肺癌發(fā)病例數(shù)位居癌癥發(fā)病的首位,每年約78.1萬發(fā)病,尤其60歲以上老年患者的肺癌發(fā)病率更高,嚴重危害老年患者生命健康[2]。非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌中最為常見的類型,約占所有肺癌病例的80-85%[3]。遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變導(dǎo)致的癌基因和抑癌基因表達異常與肺癌發(fā)生密切相關(guān)。研究表明,長鏈非編碼RNA在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色[4]。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)的轉(zhuǎn)錄本長度大于200nt,缺少開放閱讀框,無法編碼蛋白質(zhì),但lncRNA 具有調(diào)控基因表達和轉(zhuǎn)錄過程,在腫瘤發(fā)生、細胞增殖及凋亡等方面發(fā)揮作用,可作為腫瘤抑制基因和癌基因發(fā)揮作用[5]。結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 1(colon cancer associated transcript 1,CCAT1)首先在結(jié)腸癌中被發(fā)現(xiàn),在多種惡性腫瘤中表達升高,且大多與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān),對腫瘤的診斷及預(yù)后判斷具有一定的意義[6]。本研究檢測老年非小細胞肺癌患者血漿中CCAT1的表達,分析其與患者臨床特征的關(guān)系,為探討CCAT1作為早期預(yù)測及預(yù)后的標志物提供實驗基礎(chǔ)。

1 方法

1.1對象和分組 選取2018年1月至2020年1月在我院接受手術(shù)治療的老年非小細胞肺癌患者,共納入30例(NSCLS組,n=30),男性18例,女性12例,年齡60～85歲,平均(70.7±8.17)歲；腫瘤直徑:>3cm 11例,≤3cm 19例；TNM分期:Ⅰ期+Ⅱ期16例,Ⅲ期+Ⅳ期14例；出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10例。納入標準:(1)臨床確診為NSCLC；(2)原發(fā)患者,手術(shù)前未進行任何治療；(3)無其他并發(fā)癥。30例老年良性肺部疾病患者包括支氣管擴張7例,間質(zhì)性肺炎15例,肺囊腫8例(對照組,n=30),男性16例,女性14例,年齡60～80歲,平均(67.5±6.15)歲,對兩組基礎(chǔ)資料進行比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準,患者知情同意研究內(nèi)容并簽署知情同意書。

1.2材料和試劑 血清/血漿 microRNA 快速提取試劑盒、血清/血漿microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和microRNA熒光定量PCR試劑盒購至北京百奧萊博科技股份有限公司。

1.3血漿樣品制備及miRNAs提取 患者空腹狀態(tài),使用乙二胺四乙酸抗凝采血管采集各組患者外周靜脈血5mL,4℃靜置1h,3000rpm離心10min,收集上清液置于RNase-free離心管中,應(yīng)用microRNA快速提取試劑盒,按照試劑盒說明書步驟提取血漿中的microRNA,向1.5mL EP管中加入800μL miRNA Reagent,再加入300μL血漿樣本,混勻后室溫放置5min,13000rpm離心5min,取上清約1mL吸入到新的2mL EP管中,加入1mL異丙醇,上下顛倒混合均勻。將上述溶液通過吸附柱中,13000rpm離心15s,倒掉過柱液。分別經(jīng)過異丙醇、無水乙醇洗滌,在吸附柱濾芯上加入30μL RNase-free水,13000rpm離心2min,洗脫產(chǎn)物即為提取的miRNAs。

1.4反轉(zhuǎn)錄及實時定量PCR 取RNA樣品進行反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄后取2ul cDNA 進行qRT-PCR檢測,反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性 50sec,95℃ 10sec,60℃ 30sec,40個循環(huán),采用 2-△△ct法進行分析lncRNA CCAT1的相對表達量。引物序列如下:

lncRNA CCAT1 F:5′-TTGCTCACCTTACTGCCTGA-3′,

lncRNA CCAT1 R:5′-CTCATAAGGAGCGCACAACC-3′。

GAPDH F:5′-CCAGGGCTGCTTTTAACTCT-3′,

GAPDH R:5′-GGACTCCACGACGTACTCA-3′。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析,計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CCAT1在非小細胞肺癌和良性肺部疾病中的表達 應(yīng)用實時定量PCR方法檢測兩組患者外周血CCAT1的表達,結(jié)果顯示,與對照組相比,NSCLC組患者外周血中CCAT1表達增高(P<0.05),見圖1。

圖1 qRT-PCR檢測兩組患者血漿中CCAT1的表達

2.2血漿CCAT1表達與非小細胞肺癌患者臨床特征的關(guān)系 血漿CCAT1表達與NSCLC患者性別、吸煙史、病理類型、組織分化程度、TNM分期無關(guān)(P>0.05),與腫瘤大小、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05),見表1。

表1 血漿CCAT1表達與非小細胞肺癌患者臨床特征的關(guān)系

3 討論

肺癌是全球范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問題,臨床表現(xiàn)與原發(fā)灶位置和是否發(fā)生轉(zhuǎn)移有關(guān),患者早期一般無典型癥狀,確診時通常已發(fā)展到中晚期。影像學(xué)篩查如胸部X線、CT、磁共振以及PET-CT都是臨床常用肺癌檢測手段,但由于其各自的局限性,都不適用于早期肺癌的篩查,確診不及時是肺癌高病死率的主要原因之一,我國肺癌患者五年生存率僅為18.7%[7],研究新的肺癌標記物以及提高肺癌早期診斷率對提高其整體生存率至關(guān)重要。

近年來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,包括長鏈非編碼RNA(lncRNA)和miRNAs在內(nèi)的非編碼RNA表達失調(diào)在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,作為診斷和預(yù)后評估的標志物被廣泛研究[8]。lncRNA CCAT1定位于人類8q24.21,轉(zhuǎn)錄本長度為2628個核苷酸,其編碼序列位于原癌基因c-Myc增強子區(qū)域,可促進癌細胞從細胞周期G1進入S期[9]。研究顯示,CCAT1的過度表達對結(jié)直腸癌、胃癌等多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展起促進作用。在非小細胞肺癌細胞系中,CCAT1高表達,在肺癌細胞系中沉默CCAT1的表達,細胞系的增殖和侵襲受到抑制,提示CCAT1在非小細胞肺癌中發(fā)揮癌基因的作用,可能是肺癌治療的潛在靶點[10-11]。

本研究采用實時熒光定量PCR方法檢測老年非小細胞肺癌和良性肺病患者兩組患者血漿中l(wèi)ncRNA CCAT1的表達水平,發(fā)現(xiàn)與良性肺病患者相比,lncRNA CCAT1在非小細胞肺癌患者血漿中表達升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；進一步分析lncRNA CCAT1的表達及與患者臨床特征的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)lncRNA CCAT1表達與患者性別、TNM分期及分化程度無關(guān),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),與腫瘤體積及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

綜述所述,lncRNA CCAT1在老年非小細胞肺癌患者血漿中高表達,其表達水平與患者臨床病理特征關(guān)系密切,有可能是評估疾病嚴重程度潛在的分子標志物。