鄭 鋆

復旦大學附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院(福建 廈門 361006)

肝性腦病(Hepatic Encephalopathy,HE)是肝臟功能嚴重障礙和(或)門體分流所致的中樞神經系統功能失調綜合征,是急性肝衰竭和慢性肝病終末期最嚴重的并發(fā)癥之一。按病因不同將此臨床綜合征分為三種類型,其中A型為急性肝衰竭相關的肝性腦病,預后最差[1]。目前,氨和腸道來源的毒素仍然是肝性腦病發(fā)病機制的核心[2],近年來研究顯示,在肝硬化和慢性肝病人群中腸道通透性存在異常增高[3],間接表現為外周血內毒素水平和細菌DNA的增加；腸道屏障的破壞程度與肝功能Child分級呈正相關,在合并腹水的失代償期肝硬化患者中腸道通透性增加更為明顯[4-5]。但關于肝性腦病狀態(tài)下腸道通透性改變的研究尚少,故設計了本次實驗,于2020年12月至2021年3月選取雄性SD大鼠30只隨機分至正常對照組和肝性腦病模型組,模型組造模成功后根據肝性腦病臨床分級將其進一步細分為低級別肝性腦病組和高級別肝性腦病組；對比研究各組大鼠腸道通透性的差別并對其可能機制進行探討,為進一步的臨床研究提供基礎?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物 6～8周齡雄性SD大鼠30只:購自復旦大學上海醫(yī)學院實驗動物中心。

1.2實驗主要試劑 硫代乙酰胺(Thioacetamide,TAA)及FITC-Dextran:購自Sigma-Aldrich。

1.3實驗方法

1.3.1 動物分組造模 將雄性SD大鼠隨機分至正常對照組和肝性腦病模型組,正常對照組8只腹腔注射生理鹽水；肝性腦病模型組22只腹腔注射TAA(300mg/kg TAA連續(xù)3天每隔24小時腹腔注射),保證大鼠的行為自由和正常的日晝時間,然后每24h進行監(jiān)測以挑選出其中確實患有肝性腦病的大鼠[6],對造模成功的大鼠根據肝性腦病臨床分級(表1)將其進一步細分為低級別肝性腦病組(1～2級)和高級別肝性腦病組(3～4級)。

表1 SD大鼠肝性腦病臨床分級

1.3.2 離體腸道通透性測定 無菌條件下分離三組實驗鼠的空腸,放置于含8.4mM HEPES,119mM NaCl,4.7mM KCl,1.2mM MgSO4,1.2mM KH2PO4,25mM NaHCO3,2.5mM CaCl2和11mM 葡萄糖的改良Krebs-Henseleit碳酸氫鹽緩沖液(KHBB緩沖液)中。被分離腸段的一端用縫線結扎,然后用管飼針將100μL 異硫氰熒光素-右旋糖苷(FITC-Dextran,分子量4000,熒光劑FD-4,40mg/mL)注入腸腔,注射過程中注意避免損傷腸粘膜。腸段的另一端也用縫線結扎,形成8cm長的腸袋。用KHBB緩沖液漂洗后,將兩端結扎的腸袋置入2ml KHBB液中,37℃下孵育20分鐘。用熒光分光光度計測定從腸腔滲入到孵育緩沖液中的FD-4。

1.3.3 腸壁水腫程度測定 采用干濕重法比較三組實驗鼠腸壁水腫程度。取空腸一小塊,洗凈腸內容物,普通濾紙吸干表面液體,稱重(濕重),記錄重量；然后放入50℃恒溫培養(yǎng)箱中烘干,3天后再稱重(干重),記錄重量。根據濕、干重比,了解腸壁水腫程度。

1.3.4 緊密連接蛋白及炎癥因子檢測 RT-PCR法比較三組實驗鼠空腸緊密連接蛋白ZO-1和Occludin及炎癥因子TNF-α的表達水平。TRIzol試劑提取組織內總RNA,然后反轉錄為cDNA；PCR條件如下:94℃ 5分鐘,之后95℃ 15秒,60℃ 30秒循環(huán)40次；內參選用β-actin,相應的引物序列如表2所示。

表2 引物序列

1.3.5 統計方法 三組數據間比較采用多因素方差分析(PCR數據采用2-△△Ct值作為原始數據參與計算),兩兩比較采用Bonferroni法,均為雙側檢驗,以P<0.05視為有統計學差異；數據分析采用SPSS 21.0,作圖采用Graphpad Prism 6。

2 結果

肝性腦病模型組共獲得低級別肝性腦病大鼠和高級別肝性腦病大鼠各8只,死亡6只,正常對照組8只均存活；每日的肝性腦病臨床分級評估結果詳見表3。觀察造模結束后存活的各組動物體重、腸道通透性及相關緊密連接蛋白/炎癥因子表達的變化情況如下。

表3 模型組動物評估及分組情況

2.1體重變化 實驗結果提示:和對照組相比,肝性腦病組大鼠的體重有顯著下降(0.06±0.04 VS-0.07±-0.02 VS-0.17±0.03,P<0.05),具有統計學差異；高級別肝性腦病組體重下降更為明顯,且與低級別肝性腦病組相比也具有統計學差異(見圖1)。

圖1 肝性腦病組與正常對照組大鼠體重變化情況

2.2腸道通透性變化 實驗結果提示:和對照組相比,肝性腦病組大鼠的單位面積離體腸道通透性(0.82±0.11 VS 1.36±0.30 VS 1.74±0.32,P<0.05)及腸壁水腫程度(3.02±0.18 VS 3.57±0.22 VS 4.44±0.43,P<0.05)均有顯著增加,并具有統計學差異；高級別肝性腦病組腸道通透性增加更為明顯,且與低級別肝性腦病組相比也具有統計學差異(見圖2),說明肝性腦病這一病理狀態(tài)下確實存在腸道屏障的破壞,且破壞程度與肝性腦病分級存在相關。

圖2 肝性腦病組與正常對照組大鼠腸道通透性變化

2.3緊密連接蛋白及炎癥因子表達水平變化 實驗結果提示:和對照組相比,肝性腦病組大鼠的腸道緊密連接蛋白ZO-1(0.30±0.04 VS 0.27±0.05 VS 0.24±0.04,P=0.068)及Occludin(0.18±0.02 VS 0.18±0.03 VS 0.16±0.02,P=0.069)的表達下降,但不具有統計學差異,高級別肝性腦病組下降趨勢更為明顯,但與低級別肝性腦病組相比亦不具有統計學差異；炎癥因子TNF-α表達增加(0.03±0.01VS 0.04±0.01 VS 0.08±0.02,P<0.05),具有統計學差異,高級別肝性腦病組增加更為顯著,且與低級別肝性腦病組相比也具有統計學差異(見圖3),說明炎癥反應參與了腸漏的過程。

圖3 肝性腦病組與正常對照組大鼠緊密連接蛋白及炎癥因子表達水平變化

3 討論

肝性腦病根據病因不同可分為A、B、C三型。在急性肝衰竭引起的A型肝性腦病中,以肝功能嚴重障礙因素為主,而B型肝性腦病為單純門體旁路引起,無確切的肝細胞疾病,但臨床表現與C型相同；C型肝性腦病病因則為肝硬化伴門脈高壓和(或)門體分流。不同病因的HE發(fā)病機制均主要涉及三個環(huán)節(jié):第一,循環(huán)毒素如氨的產生,其中腸道是各類毒素進入血液循環(huán)最主要的門戶；第二,肝功能損傷和(或)門體分流病理生理基礎存在:肝功能障礙導致肝臟的生物轉化能力下降,門體旁路導致腸道毒素未經肝臟直接分流進入體循環(huán)；第三,突破血-腦屏障的毒素對在不同水平上對腦功能的損害[2]。作為毒素來源的腸道是本研究關注的核心,因在健康個體中,腸道屏障完整,具有防止腸腔內有害物質如細菌和毒素等穿過腸粘膜進入體內其他組織器官和血液循環(huán)的結構和功能；而在肝損的病理狀態(tài)下,腸道屏障破壞可能導致毒素進入血液循環(huán)增加,促進HE的發(fā)生與發(fā)展。

本實驗采用的是TAA致大鼠急性肝衰竭模型,該模型具有良好的重復性和可行性,是目前國內外相對成熟和常用的動物HE模型。在既往研究中觀察到在造模過程中實驗動物會出現不同程度的消化道癥狀如進食減少、明顯的腹部膨隆、胃腸型等,腸壁組織病理學可見上皮細胞脫落及炎細胞浸潤、絨毛壞死,符合腸道屏障功能障礙的表現[7]。這與本實驗中觀察到的HE狀態(tài)下離體腸道通透性異常增高、腸壁水腫的結果相符合(P<0.05),且肝性腦病臨床分級越高、腸道通透性增加越顯著；以上都從不同角度說明腸道屏障破壞參與了HE的發(fā)病。

完整的腸道屏障包括物理屏障、化學屏障、免疫屏障、細菌屏障等,其中物理屏障主要指上皮細胞自身的完整性及細胞間的緊密連接(Tight Junction,TJ)。緊密連接包含一系列跨膜蛋白家族,包括Occludin、Claudin等,其胞內部分通過ZO蛋白與細胞內骨架結構相連接以起到錨定作用,并受飲食、激素、炎癥因子等因素影響,通過磷酸化方式發(fā)生構象改變,調節(jié)腸腔內各類大分子的轉運[8,9]。研究認為,在急慢性肝衰竭狀態(tài)時腸道局部及全身炎癥因子表達增加,而炎癥反應可引起緊密連接蛋白表達水平的下調,腸道屏障異常開放,導致菌群移位、內毒素血癥等,進一步加重肝損,同時腸道局部炎癥狀態(tài)又加劇了腸漏,形成惡性循環(huán)[10-13]。而TNF-α作為重要的促炎因子之一,已有研究提示針對腸道局部的TNF-α拮抗劑可抑制炎癥反應,減輕因腸道屏障破壞引起的機體慢性炎癥狀態(tài)[14]。在本實驗中觀察到HE大鼠腸道組織局部TNF-α表達增高(0.03±0.01VS 0.04±0.01 VS 0.08±0.02,P<0.05),并具有統計學差異,緊密連接蛋白ZO-1及Occludin在基因表達水平方面存在下降趨勢,與Luo等人的研究結果一致[15]；說明炎癥反應引起的緊密連接蛋白表達下調與腸道屏障破壞和HE的發(fā)病相關。但研究在緊密連接蛋白基因表達水平方面未得到陽性結果,可能與樣本量不足及檢測手段單一有關,有文獻報道稱,LPS誘導的腸上皮細胞損傷可導致ZO-1在蛋白表達水平上的下降(Western Blot法證實),同時免疫組化還發(fā)現其在細胞表面上的分布方式存在異常,表現為數量減少且更為碎片化[16]。

綜上,腸道通透性增加是肝性腦病發(fā)生發(fā)展的重要驅動因素,而修復腸道屏障可能是未來具有吸引力的治療手段,鑒于它能夠避免針對其他一些致病機制進行治療的不良反應(如針對腸道菌群容易產生耐藥或菌群多樣性減少等),并且可以和其他現有治療手段相結合。對腸道屏障認識的不斷深入,將使得未來開發(fā)修復腸道屏障的藥物成為可能,以造福于臨床HE患者。