張 沖，王 濤,2，吳 昊,2，曾 曉，孫玲玲，劉 彭

(1 徐州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 徐州 221000；2 徐州市生化資源高效綜合利用工程研究中心，江蘇 徐州 221000；3 青島市即墨區(qū)綜合檢驗(yàn)檢測(cè)公司，山東 青島 266200；4 濰坊市食品藥品檢驗(yàn)局，山東 濰坊 261100)

槲皮素是一種天然黃酮類物質(zhì)，具有多種生物活性，但是其在水中分散性差的特性限制了在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。目前，國(guó)內(nèi)外研究中一般采用有機(jī)溶劑對(duì)槲皮素進(jìn)行溶解，應(yīng)用在藥物開發(fā)領(lǐng)域，但是有機(jī)溶劑成本高，且大部分具有毒性，不適合在藥物開發(fā)過程中使用。近年來，許多專家學(xué)者采用親水性載體對(duì)槲皮素進(jìn)行包埋的方式改善槲皮素的應(yīng)用效果，這種方法對(duì)槲皮素在水中的分散性改善效果顯著，且能起到延長(zhǎng)槲皮素氧化變質(zhì)周期，控制相關(guān)藥物在動(dòng)物體內(nèi)的釋放速度等多種效果，受到廣大學(xué)者的追捧。本研究主要是選用一種雙親性的高分子聚合物嵌段式聚醚(F127)，對(duì)槲皮素進(jìn)行裝載，設(shè)計(jì)制備納米級(jí)別的槲皮素/F127藥物裝載體系，研究其制備工藝參數(shù)，嘗試改善槲皮素在水中的分散效果。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

HJ-6A多頭磁力加熱攪拌器，常州國(guó)華電器有限公司；Allegra X-15R離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；XO-5200DTSN(25-45KHZ)超聲波清洗機(jī)，南京先歐儀器制造有限公司；JA5003B電子天平，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；TEM-H7600透射電鏡，日本日立株式會(huì)社；BT-90納米激光粒度儀，丹東百特儀器有限公司；1-2LD/PLUS真空冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Christ公司；WFZ UV-2000紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯儀器有限公司。

嵌段式聚醚F-127(分子式:C7H16O4，S30692-500g)上海希格瑪高技術(shù)有限公司；槲皮素,上海阿拉丁生化科技有限公司；無水乙醇(AR)，廣東光華科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 槲皮素/F127納米裝載體系的制備

用超純水配制一定濃度的F127溶液備用。準(zhǔn)確稱取2.5 mg，5 mg，7.5 mg，10 mg槲皮素分別分散在5 mL濃度為0.1% F127分散液中，制備得到槲皮素濃度為0.5 mg/mL,1 mg/mL,1.5 mg/mL,2 mg/mL的槲皮素/F127混合溶液，將上述混合溶液在水浴超聲處理器中處理20分鐘，然后混合液在100 psi壓力下利用高壓均質(zhì)機(jī)處理多次，在超速離心機(jī)(3000 rpm，5 min)中離心，收集沉淀，冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥24小時(shí)，得到樣品。

1.2.2 槲皮素含量測(cè)定

取一支干燥的試管加入10 mL蒸餾水，再加入10 mg槲皮素，混合均勻，取一滴稀釋到0.125 mg/mL，用紫外分光光度計(jì)測(cè)其吸光度，測(cè)完再將比色皿中的溶液取出，將其稀釋一倍在測(cè)其測(cè)其吸光度，如此這樣共測(cè)6次，記錄數(shù)據(jù)且繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 槲皮素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of quercetin content

1.2.3 槲皮素/F127納米裝載體系理化性質(zhì)的測(cè)定

槲皮素/F127納米裝載體系粒徑的大小分布和 Zeta 電位由 激光粒度測(cè)試儀測(cè)定，該系列配備的 He+Ne 激光束波長(zhǎng)為 633 nm，固定散射角為90°。稱取0.5 mg樣品分散在蒸餾水中，裝入比色皿，并在25 ℃下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定。

1.2.4 槲皮素/F127納米裝載體系藥物裝載率的測(cè)定

在超聲處理和高壓均質(zhì)的過程中，槲皮素被裝載到 F127 上，收集離心上清液。具體而言，將冷凍干燥后得到的樣品用蒸餾水洗滌 3 次，以去除表面上未結(jié)合的，弱結(jié)合的和弱吸附的槲皮素。將所有上清液混合在一起，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，波長(zhǎng)為 240 nm。然后使用從構(gòu)建的校準(zhǔn)曲線獲得的回歸方程式計(jì)算槲皮素的含量。通過從槲皮素總數(shù)中減去上清液中槲皮素的含量來定量已裝載的槲皮素的量。

槲皮素的裝載率用如下公式計(jì)算:

(1)

2 結(jié)果與討論

2.1 槲皮素/F127納米裝載體系理化性質(zhì)

對(duì)制備得到的納米裝載體系相關(guān)性質(zhì)如粒徑平均值、載藥率、多分散系數(shù)和 Zeta 電位進(jìn)行了測(cè)試和評(píng)估。每個(gè)條件重復(fù)三次，標(biāo)準(zhǔn)誤差被繪制為誤差線。最終正交試驗(yàn)以藥物粒徑的大小為響應(yīng)值，選出最優(yōu)試驗(yàn)工藝。

2.1.1 料液比對(duì)槲皮素/F127納米裝載體系特性的影響

從圖2和圖3中我們可以看到，從1:1到1:4時(shí)，藥物的粒徑大小呈下降趨勢(shì)，比率為1:4時(shí)粒徑大小降到最小，在1:5時(shí)粒徑大小出現(xiàn)轉(zhuǎn)折性增大，數(shù)字均值反彈至457±20納米。裝載率隨著槲皮素與F127的比率的增加，也呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，但無明顯差異，在比率為1:4時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)。劉雅云[1]在基于茶多酚-殼聚糖納米緩釋體系的納米纖維素/淀粉活性包裝膜的研究中也提到了相似的結(jié)論得到了粒徑大小在200 nm左右的納米粒子。

圖2 料液比對(duì)槲皮素/F127納米裝載體系粒徑大小的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on particle size of quercetin/f127 nano loading system

圖3 料液比對(duì)槲皮素/F127納米裝載體系裝載率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on loading rate of quercetin/F127 nano loading system

2.1.2 超聲處理時(shí)間對(duì)槲皮素/F127納米裝載體系特性的影響

從圖4和圖5中可以看出超聲時(shí)間對(duì)粒徑大小、裝載率影響很小。粒徑大小呈緩慢減小又增大的趨勢(shì)，在超聲處理20 min時(shí)最小，數(shù)字均值在(199±20) nm。裝載率在超聲5～10 min時(shí)變化最為明顯，在超聲處理10 min時(shí)最高，隨后又呈下降趨勢(shì)逐漸降低。張玉杰[2]在超聲對(duì)淀粉結(jié)構(gòu)、性質(zhì)的影響及制備辛烯基琥珀酸淀粉酯的作用機(jī)理中提到在超聲處理時(shí)間為8 min時(shí),淀粉顆粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)變得有序化,熱穩(wěn)定性和糊化焓值有所升高,顆粒內(nèi)部聚集成球體結(jié)構(gòu),此階段與機(jī)械力化學(xué)效應(yīng)的聚集階段相一致，與我們測(cè)得的在10 min時(shí)其理化性質(zhì)較好相類似。李季楠[3]在葉黃素納米乳化液的制備研究當(dāng)中也得到了類似的結(jié)論。

圖4 超聲處理時(shí)間對(duì)槲皮素/F127納米裝 載體系粒徑大小的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on particle size of quercetin/F127 nano loading system

圖5 超聲處理時(shí)間對(duì)槲皮素/F127納米裝 載體系裝載率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on loading rate of quercetin/f127 nano loading system

2.1.3 均質(zhì)壓力對(duì)槲皮素/F127納米裝載體系特性的影響

由圖6和圖7可以看出均質(zhì)的壓力對(duì)各種性質(zhì)有很明顯的影響[4-5]，隨著均質(zhì)器壓力的不斷增加，粒徑大小急劇減小，平均數(shù)從(399±20) nm減小到(88±20) nm，在壓力為110 psi時(shí)最小，壓力繼續(xù)增大至120 psi，粒徑緩慢變大。裝載率在壓力由80 psi到100 psi的增大過程中不斷提高，壓力到達(dá)100 psi時(shí)出現(xiàn)明顯轉(zhuǎn)折，壓力繼續(xù)增大時(shí)，裝載率逐漸降低，在壓力為100 psi時(shí)得到最高裝載率為58%，但相較于其他條件下的裝載率則略有下降。

圖6 均質(zhì)壓力對(duì)槲皮素/F127納米裝載體系粒徑的影響Fig.6 Effect of homogenizing pressure on particle size of quercetin/F127 nano loading system

圖7 均質(zhì)壓力對(duì)槲皮素/F127納米裝載體系裝載率的影響Fig.7 Effect of homogeneous pressure on loading rate of quercetin/F127 nano loading system

3 結(jié) 論

采用單因素實(shí)驗(yàn)初步研究了槲皮素/F127納米裝載體系的構(gòu)建方法，通過研究發(fā)現(xiàn)在料液比為1:4，超聲處理時(shí)間為20 min，均質(zhì)壓力為100 psi時(shí)，能夠制得粒徑在200 nm左右的槲皮素/F127納米藥物裝載體系，該體系的藥物裝載率可達(dá)到58%。該研究?jī)H為階段性研究結(jié)果，后續(xù)工作應(yīng)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步確認(rèn)實(shí)驗(yàn)參數(shù)，并對(duì)樣品的理化性質(zhì)進(jìn)行表征。