焦文強(qiáng)，邢廣旭，徐引弟，王 麗，王治方，王克領(lǐng)

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；3.河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

豬德爾塔冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)于2012年在香港首次報(bào)道[1]，目前亞洲的多個(gè)國家均有PDCoV的報(bào)道[2-4]，在我國，多個(gè)省份也都檢測到PDCoV，發(fā)病率差異較大[5-7]。其臨床表現(xiàn)比豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)相對溫和，但是不同區(qū)域陽性率差異較大，可能是由于PDCoV不斷遺傳變異導(dǎo)致不同區(qū)域的流行毒株毒力差異。豬腸道α冠狀病毒(Porcine enteric alphacoronavirus,PEAV)由2個(gè)研究團(tuán)隊(duì)于2017年報(bào)道，其是一種新型Bat-HKU2樣冠狀病毒[8-9]，死亡率高達(dá)90%[10]。

仔豬腹瀉是危害養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要疫病，目前引起仔豬腹瀉病原種類繁多，多種病原混合感染是誘發(fā)仔豬腹瀉的重要原因。PEDV是當(dāng)前主要的仔豬腹瀉病原，PDCoV和PEAV是近年來新近報(bào)道誘發(fā)腹瀉的病原體，但是目前尚沒有報(bào)道證明PDCoV、PEAV和PEDV混合感染的情況。因此，對這3種病原混合感染情況進(jìn)行分析可以確定目前仔豬腹瀉中新發(fā)病原與現(xiàn)存主要病原在豬群中的流行情況，為腹瀉類疾病防控措施提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、DL2 000 DNA marker、PrimeSTAR Max Premix(2×)高保真酶、DNA純化回收試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒、pMD20-T simple載體、大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；RNA提取試劑盒，購自QIAGEN公司。

1.2 病料 鑒定為PEDV陽性的腹瀉疑似病料(2014—2018年采集于河南、河北、山東、山西、江西等省份)由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 檢測PDCoV引物根據(jù)病毒保守區(qū)域設(shè)計(jì)合成，上游引物：5′-GCTGATGATCTACTCGATT-3′,下游引物：5′-ACTACTTCAAGCTCAGGGAGCTT-3′，目的片段大小約為866 bp。檢測PEAV的引物參考PEAVS基因的序列，上游引物：5′-GGCCTCTATTAGAGTGCTTTA-3′,下游引物:5′-GTAGGATATTCAACCTCACTAT-3′，目的片段大小為770 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3.2 PDCoV和PEAV的檢測 按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參考Prime STAR Max Premix(2×)高保真說明書進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后取5 μL樣品進(jìn)行凝膠電泳檢測。

1.3.3 PDCoV和PEAVS基因的克隆 對于PDCoV和PEAV陽性的樣品，采用參考文獻(xiàn)[11-12]的引物進(jìn)行S基因全長的擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增結(jié)束后回收目的片段，并與pMD20-T simple連接，轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆進(jìn)行測序，使用DNASTAR中的 Edit Seq進(jìn)行序列拼接，采用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 PEDV、PDCoV和PEAV共感染的比例 在191份檢測為PEDV陽性樣品中，PDCoV和PEAV陽性樣品分別為12份和1份。PEDV、PDCoV和PEAV共感染的比例為0.52%。PDCoV和PEAV擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。

圖1 PDCoV和PEAV的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of PDCoV and PEAVM:DL2 000 DNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～2:陰性對照；3～4:陽性對照；5～6:PDCoV與PEAV基因片段M:DL2 000 DNA marker;1-2:Negative control;3-4:Positive control;5-6:PDCoV and PEAV gene fragment

2.2 PDCoV和PEAVS基因的克隆 本試驗(yàn)共獲得5株P(guān)DCoVS基因序列，但未能得到PEAV毒株S基因序列。

2.3 PDCoV 核苷酸與氨基酸同源性分析 將本試驗(yàn)得到的CH-HEBHD-2016(2016年采集自河北邯鄲)、CH-HENNY-2017(2017年采集自河南南陽)、CH-HENXY-2016(2016年采集自河南信陽)、CH-HENZK-2017(2017年采集自河南周口)、CH-SHANXCZ-2017(2017年采集自山西長治)這5株P(guān)DCoVS基因序列與GenBank中下載的序列進(jìn)行比對，結(jié)果如圖2、圖3所示，本試驗(yàn)得到的5株序列與GenBank中下載的序列核苷酸同源性為97.2%～99.3%，氨基酸同源性在96.6%～98.9%。

圖2 PDCoV S基因核苷酸序列的比對分析Fig.2 Nucleotide homology comparative analysis of S gene of PDCoV

圖3 PDCoV S基因氨基酸序列的比對分析Fig.3 Amino acid homology comparative analysis of S gene of PDCoV

2.4 PDCoVS基因遺傳進(jìn)化分析 將本試驗(yàn)得到的5株P(guān)DCoV與GenBank中下載的序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖4所示，CH-HENNY-2017、CH-HENXY-2016、CH-SHANXCZ-2017、CH-HEBHD-2017這4株序列與HNZK-06形成一個(gè)分支，親緣關(guān)系比較接近；而CH-HENZK-2017與CH-GDD5-2014、CH-SXD2-2015形成一個(gè)分支，親緣關(guān)系較為接近。

圖4 基于PDCoV S基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of PDCoV based on S gene▲：本試驗(yàn)分離株▲：The strains isolated in this study

3 討論

腹瀉類疾病一直是困擾養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要疾病，特別是哺乳仔豬，腹瀉不僅會(huì)造成斷奶仔豬體重下降，影響保育豬增重，并且降低豬只對疾病抵抗力；嚴(yán)重的腹瀉會(huì)因脫水而死亡。冠狀病毒是影響仔豬腹瀉的重要病原之一，PDCoV和PEAV是新近報(bào)道的2種誘發(fā)腹瀉的冠狀病毒，對臨床采集樣本進(jìn)行PDCoV和PEAV感染情況分析對于腹瀉疫病的防控具有重要意義；同時(shí)，PEDV已經(jīng)被確定為目前引起仔豬腹瀉的最主要的病原，考慮到臨床生產(chǎn)中疫病混合感染的復(fù)雜性和多樣性，開展PEDV、PDCoV和PEAV共感染分析，對于仔豬腹瀉的防控具有重要意義。

本試驗(yàn)中，在191份檢測為PEDV陽性樣品中，PDCoV和PEAV陽性樣品分別為12份和1份。PEDV、PDCoV和PEAV共感染的比例為0.52%。共得到5株P(guān)DCoV序列，未能得到PEAV毒株S基因序列。結(jié)果表明，目前河南省及周邊省份PEDV仍然是主要的仔豬腹瀉病原，但是PDCoV與PEAV也已經(jīng)在豬群中傳播，未來仔豬腹瀉病原可能更加復(fù)雜。由于冠狀病毒的S蛋白識(shí)別并結(jié)合細(xì)胞表面受體，誘導(dǎo)病毒囊膜和靶細(xì)胞膜進(jìn)行融合，其編碼的抗原表位誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，因此，S蛋白被廣泛用于疫苗研發(fā)和遺傳進(jìn)化分析[13]。

根據(jù)PDCoV 5株序列的核苷酸和氨基酸比對結(jié)果分析，這5株序列與國內(nèi)分離株核苷酸同源性為97.2%～99.3%，氨基酸同源性為96.6%～98.9%，表明核苷酸編碼的氨基酸已經(jīng)發(fā)生變異，這種變異對于病毒的致病性和相關(guān)生物活性的影響有待于進(jìn)一步分析。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，CH-HENNY-2017、CH-HENXY-2016、CH-SHANXCZ-2017、CH-HEBHD-2017這4株序列與HNZK-06形成一個(gè)分支，親緣關(guān)系比較接近，呈現(xiàn)出明顯的低于特征；而CH-HENZK-2017與CH-GDD5-2014、CH-SXD2-2015形成一個(gè)分支，親緣關(guān)系較為接近。本試驗(yàn)結(jié)果提示，河南范圍內(nèi)流行的PDCoV可能是多種不同亞型，相互之間發(fā)生變異或者重組。由于本試驗(yàn)獲得的樣本數(shù)過少，需加大臨床中PDCoV的采集工作，獲得更多的PDCoV數(shù)據(jù)才能夠進(jìn)一步分析。