黃袁慧,王乃迪，陳玉紅，高曉藝,3，劉 洋，顧小雪，楊 林，辛盛鵬，王傳彬,劉玉良

(1.中國動物疫病預防控制中心，北京 大興 102618；2.廣西大學動物科技學院，廣西 南寧 530005；3.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北 邯鄲 056038)

雞傳染性支氣管炎(Infectious bronchitis,IB)是由冠狀病毒科冠狀病毒屬中的傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的發(fā)生于雞只的一種急性、高度接觸性疾病，主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀[1]。IB是發(fā)病率和死亡率均較高的一種重要疫病，該病不僅會導致發(fā)病雞死亡，還會使發(fā)病雞的生產(chǎn)性能下降，對養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展危害巨大[2]。IBV血清型多，病毒極易發(fā)生變異，不同毒株之間的交叉保護力很弱。研究發(fā)現(xiàn)，IBV的基因型共有9種：QX型(又稱LX4型)、CK/CH/LSC/99I型、J2型、4/91型、JP型、TW型、Italy02型、Tc07-2型和Mass型。我國IBV流行株的基因型是在QX型、LSC/99I型、793/B型、LDL/97I型和TWⅠ型的基礎上經(jīng)過同源重組而產(chǎn)生的[3]。IBV基因型眾多，引起的臨床癥狀和病理變化差異較大，因此，根據(jù)臨床癥狀只能做出初步診斷，確診則需要實驗室檢測。目前，檢測IBV的方法主要有病毒分離鑒定、血清學方法、分子生物學方法等[3-4]。RT-PCR方法具有簡便、快速以及敏感性和特異性強等優(yōu)點[5]，國家標準《雞傳染性支氣管炎診斷技術》(GB/T 23197—2008)中也描述了該檢測方法。但是，目前我國尚缺乏相應的IBV核酸標準物質，因此，無法評價檢測試劑的質量和檢測方法的可靠性以及驗證檢測能力等?；诖耍菊n題組申報了國家標準物質研制計劃并獲得批準立項，繼而開展了IBV核酸檢測專用標準物質研制工作，所研制的標準物質有望解決在該病毒檢測中存在的實際問題。

1 材料與方法

1.1 毒株 IBV M41株凍干病毒，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 主要儀器和試劑 KingFisher 96自動化核酸提取儀、Steril GARD Advance生物安全柜、ABI Veriti型PCR儀、UVP凝膠成像分析系統(tǒng)。磁珠法病毒RNA提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；GoTaq?Green Master Mix，購自Promega公司；引物和探針由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 病毒的繁殖和鑒定 IBV M41株凍干病毒用1 mL無菌PBS完全復溶，接種9～11日齡SPF雞胚，孵育和收獲病毒。按照國家標準《雞傳染性支氣管炎診斷技術》(GB/T 23197—2008)所述方法，提取上述尿囊液中IBV基因組RNA，用標準中上游引物3′s(5′-GGAAGATAGGCATGTAGCTT-3′)和下游引物3′x(5′-CTAACTCTATACTAGCCTAT-3′)進行擴增，同時擴增SPF雞胚尿囊液作為陰性對照。將擴增產(chǎn)物純化后連接T載體進行測序驗證。

1.4 標準物質的制備 將上述病毒進行無菌和外源病毒檢驗，合格后進行分裝，于-70 ℃保存?zhèn)溆?。將IBV逐代擴增和檢驗，將擴增3代繁殖的M41株IBV滅活，將滅活后的病毒接種10日齡SPF雞胚后，根據(jù)雞胚死亡情況以及收集雞胚尿囊液進行RT-PCR擴增的結果，判斷滅活效果，同時擴增滅活前的IBV和SPF雞胚尿囊液作為陽性和陰性對照。將擴繁和鑒定并已滅活的病毒與凍干保護劑按適當比例充分混合，分裝。置于-80 ℃冰箱預凍2 h后，迅速移到凍干機中凍干，制備標準物質，然后置于-80 ℃冰箱中凍存。

1.5 標準物質的檢驗 (1)物理性狀檢驗：肉眼檢驗所制備的標準物質的外觀物理性狀。(2)無菌檢驗：取所制備的標準物質復溶后在無抗生素的LB平板上涂板，培養(yǎng)后觀察有無菌落生長。(3)支原體檢驗：取復溶的標準物質，用支原體檢測試劑盒進行支原體檢測。(4)外源病毒檢驗：標準物質復溶后，提取核酸，檢測是否含有禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、鴨坦布蘇病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)、禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)、小鵝瘟病毒(Goose parvovirus,GPV)、馬立克氏病病毒(Marek’s virus,MDV)、雞傳染性喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖征病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)、雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒(Egg drop syndrome virus-76,EDSV-76)、傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal virus,IBDV)，同時設立各病毒陽性對照和陰性對照(SPF雞胚尿囊液)。(5)病毒滅活檢驗：將制備的標準物質復溶后，接種9～11日齡SPF雞胚，連續(xù)傳3代，觀察各代次雞胚是否死亡，同時用國家標準(GB/T 23197—2008)中RT-PCR方法進行檢測。

1.6 均勻性評估 在分裝保存的IBV核酸檢測專用核酸標準物質中隨機抽取 15管樣品進行檢測，每管重復3次。檢測方法為本標準物質制備時所用的標定方法，采用單因素方差分析對標準物品進行均勻性分析。

1.7 穩(wěn)定性監(jiān)測 對所制備的標準物質的短期穩(wěn)定性監(jiān)測是測試模擬運輸條件下標準物質的穩(wěn)定性，長期穩(wěn)定性則是測試標準物質在長期貯存條件下的穩(wěn)定性。(1)短期穩(wěn)定性監(jiān)測：將標準物質在4 ℃環(huán)境下存放7 d和14 d；在25 ℃環(huán)境下存放 1、3 d和5 d；在37 ℃環(huán)境下存放1 d和3 d。然后，與存放在-80 ℃ 環(huán)境中的標準物質同時進行熒光RT-PCR檢測，檢測結果分別進行t檢驗分析。(2)長期穩(wěn)定性監(jiān)測：將標準物質在(-20±5)℃條件下貯存，分別在第1、3、6、9、12個月抽取5瓶進行熒光RT-PCR檢測，每管樣品重復檢測2次，計算平均值，進行穩(wěn)定性分析。

1.8 合作定值 根據(jù)M41株IBVN基因保守區(qū)域基因序列，應用Primer Primier 5.0軟件設計引物，擴增N基因ORF序列后連接到pGEM Teasy載體并鑒定。利用公式拷貝數(shù)(copies/μL)=[(ng/μL×10-9)×(6.02×1023)]÷(堿基數(shù)×660)，計算重組質粒pGEM Teasy-IBV-N拷貝數(shù)。以拷貝數(shù)為x軸，以熒光RT-PCR中的Ct平均值作為y軸，繪制散點圖并擬合直線。根據(jù)IBV M41株及參考毒株保守序列，設計合成1對引物和TaqMan探針，經(jīng)過優(yōu)化，建立合作定值方法。該方法反應體系：2×Quant One Step Probe RT-qPCR Master Mix 10 μL,HotmasterTaqpolymerase(2.5 U/μL)0.8 μL，上下游引物混合物(10 pmol/μL)1.6 μL,IBV-268-prob探針(10 pmol/μL)0.8 μL，RNasin(40 U/μL)0.3 μL，Quant RTase 0.3 μL，模板200 ng,加滅菌蒸餾水補充到20 μL；熒光RT-PCR反應條件:42 ℃ 45 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；40個循環(huán)。選擇9家具有病毒核酸檢測資質并能開展相關工作的權威實驗室對所制備的標準物質進行合作定值，每家檢測2管，每管重復檢測2次，采用上述所建立的熒光RT-PCR方法進行定值。

2 結果

2.1 原料的制備和鑒定 提取接種的尿囊液中IBV基因組RNA，用國家標準(GB/T 23197—2008)中RT-PCR方法進行擴增，結果可擴增出大小約為290 bp的特異性條帶(圖1)。測序結果顯示，擴增片段序列與已發(fā)表的IBV序列(GenBank：MK937830.1)完全一致(結果略)，表明所獲得的原料為IBV。

圖1 RT-PCR鑒定IBV M41株Fig.1 Identification of IBV M41 strain by RT-PCR1：陰性對照；2～5：IBV M41株(不同雞胚繁殖的病毒)；M：DNA分子量標準(DL2 000)1:Negative control;2-5:IBV M41 strain from different embryonated SPF chicken eggs;M:Marker(DL2 000)

所制備的IBV核酸檢測專用標準物質外觀呈白色塊狀固體，無氣泡。如中插彩版圖2所示。

圖2 IBV核酸檢測用標準物質成品Fig.2 Reference material for nucleic acid detection of IBV

2.2 標準物質檢驗 將所制備的標準物質經(jīng)培養(yǎng)檢測，結果無菌落生長；用支原體檢測試劑盒檢測，結果無擴增條帶(圖3)，表明該標準物質無支原體污染。用PCR、RT-PCR、熒光PCR和熒光RT-PCR方法擴增上述其他常見禽病病原，結果均無特異性擴增條帶或擴增曲線，表明該標準物質純凈，無外源病毒干擾。將標準物質在雞胚上連續(xù)傳3代，結果未發(fā)現(xiàn)雞胚死亡，此外，用上述熒光RT-PCR方法進行檢測，結果均為陰性，說明該標準物質已被滅活。

圖3 支原體RT-PCR檢測結果Fig.3 The results of RT-PCR detection of MycoplasmaM：DNA分子量標準(DL2 000)；1：支原體陽性對照；2：IBV標準物質M:Marker(DL2 000);1:Mycoplasma positive control;2:Reference material for IBV

2.3 均勻性評估 采用隨機順序重復測量的方法，將標準物質順序編碼，隨機抽取15瓶標準物質，每管樣品檢測3次，采用單因素方差分析方法對標準物品進行均勻性分析。結果顯示，熒光RT-PCR檢測結果均為IBV陽性。根據(jù)所得的Ct值以及測量次數(shù)分別計算出數(shù)據(jù)之和、平均數(shù)以及方差，最后采用單因素方差分析方法對標準物質進行均勻性分析，根據(jù)查表獲得臨界值的F值，計算方差均方α值，結果為F

表1 方差分析Table 1 Variance analysis

2.4 穩(wěn)定性評估

2.4.1 短期穩(wěn)定性評估 取適量的標準物質在4、25 ℃ 和 37 ℃條件下，分別存放不同長度時間，然后分別與存放在-80 ℃環(huán)境中的標準物質的檢測結果進行t檢驗統(tǒng)計分析。根據(jù)對照組在-80 ℃條件下標準物質熒光RT-PCR檢測的Ct值結果，計算出均值及標準差。結果如表2～4所示，該標準物質在4、25 ℃和 37 ℃環(huán)境中可穩(wěn)定保存60、7 d和3 d。

表2 4 ℃條件下穩(wěn)定性監(jiān)測結果Table 2 Stability monitoring results of reference material stored at 4 ℃

2.4.2 長期穩(wěn)定性評估 在第1、3、6、9、12個月，每次抽取5管標準物質，每管樣品重復檢測2次，計算均值，進行穩(wěn)定性分析。結果如表5所示，該標準物質穩(wěn)定，因此，本標準物質在-20 ℃環(huán)境下可穩(wěn)定12個月。

表4 37 ℃條件下穩(wěn)定性監(jiān)測結果Table 4 Stability monitoring results of reference material stored at 37 ℃

表5 在-20 ℃保存條件下長期穩(wěn)定性檢測結果Table 5 Stability monitoring results after long-term preservation at -20 ℃

2.5 標準物質的定值 通過計算，pGEM Teasy-IBV-N重組質粒拷貝數(shù)為7.2×107拷貝/μL。以拷貝數(shù)為x軸，平均值Ct為y軸，繪制散點圖并擬合直線(如中插彩版圖4)。結果顯示，所建立的熒光定量RT-PCR方法的擬合直線的線性關系良好，標準曲線為y=-3.427x+37.81，R2達0.999，斜率為-3.427，擴增效率為95.79%。

圖4 IBV檢測的熒光RT-PCR方法標準曲線Fig.4 Standard curve of the real-time RT-PCR for IBV detection

將所制備的標準物質冷鏈寄送到9家實驗室，每家2管，每管重復檢測2次，由2名實驗員同時進行試驗。檢測結果顯示均為IBV陽性(表6)。合作定值中，各實驗室反饋的熒光RT-PCR的Ct值，在95%置信區(qū)間下，計算該標準物質的平均Ct值為21.84±1.70，即為該標準物質的參考值，可用于質量控制和穩(wěn)定性監(jiān)測的參考值。

表6 合作定值結果(Ct值)Table 6 Results of cooperating detection(Ct values)

3 討論

雞傳染性支氣管炎是由支氣管炎病毒感染所引起的一種重要禽傳染病，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，一年四季都可發(fā)生，而且，該病目前沒有特效的治療藥物，只能依靠有效的診斷、監(jiān)測、疫苗免疫以及加強生物安全管理等綜合措施來防控[6-7]。通過臨床表現(xiàn)和剖檢后觀察病理變化可對該病初步診斷，但確診需借助實驗室檢測，最常用的方法為血清學試驗和分子生物學檢測技術[4-6]。血清學試驗主要有病毒中和試驗、熒光抗體試驗、瓊脂擴散試驗、間接免疫熒光試驗等。而分子生物學診斷方法主要是常規(guī)RT-PCR和熒光RT-PCR方法[4,7]。

RT-PCR方法和熒光RT-PCR方法操作簡單、快速、方便，特異性和敏感性高。但是，由于不同實驗室間在檢測試劑、儀器設備、檢測人員和試驗操作技能水平等諸多方面存有差異，不同的實驗室之間的檢測結果難以進行比對和評價，因此，需要制備一種雞傳染性支氣管炎病毒核酸檢測專用標準物質，作為對照品，用于質量控制和比對評價，以實現(xiàn)不同實驗室之間在檢測水平上可比較和可溯源[8]。但是，目前在我國尚未見有雞傳染性支氣管炎病毒核酸檢測用標準物質研制的報道。

本研究中，依照標準物質研制的基本原則和要求[9]，成功研制出雞傳染性支氣管炎病毒核酸檢測專用標準物質，并對研制的標準物質進行了無菌檢驗、均勻性研究、穩(wěn)定性評估及合作定值，結果表明，所制備的標準物質純凈均勻，穩(wěn)定性好，無菌安全，無生物傳染風險，易于保存，可作為雞傳染性支氣管炎病毒核酸檢測用的質控品，具有重要的實際應用價值。該標準物質的應用將有助于雞傳染性支氣管炎病毒RT-PCR和熒光RT-PCR檢測方法的標準化，解決不同實驗室、不同操作人員以及不同試驗條件等差異下檢測結果不能比對評價等問題，從而使得檢測結果更加準確可靠，有利于提高實驗室檢測技術水平。