徐鳳宇，邱子怡，孫 亮，馬紅霞，高云航，么乃全

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118；2.動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，吉林 長春 130118)

鏈球菌分布廣泛，有些可致人或動物敗血癥、乳腺炎、肺炎、化膿性疾病及腦膿腫等[1]。隨著抗生素廣泛應(yīng)用，鏈球菌對抗生素的耐藥性逐漸增強，關(guān)琳等[2]報道15株豬鏈球菌9型對大環(huán)內(nèi)酯類及林可胺類耐藥率為100%，對四環(huán)素及鏈霉素耐藥率為93.3%，所有菌株達七重耐藥。主動外排機制和靶位修飾、核糖體保護蛋白、鈍化或滅活抗生素、產(chǎn)生生物被膜等是鏈球菌耐藥的原因[3]；豬鏈球菌對桿菌肽的抗性與包含SstF、SstE、SstG的ABC 轉(zhuǎn)運系統(tǒng)有關(guān)[4]。為防治鏈球菌病，研究者不懈開發(fā)新生物防治劑，內(nèi)溶素、噬菌體及其裂解酶[5-6]等成為研究目標。

除直接防治鏈球菌病外，噬菌體在鏈球菌群體形成、遺傳變異、致病性、抗生素抗性等方面也扮演重要角色[7]；研究噬菌體可幫助了解細菌生態(tài)學(xué)和進化，如含噬菌體SMP的溶原性豬鏈球菌SS2-4(SMP)毒力明顯強于野生株、生長更快、菌鏈變短[8]；噬菌體也被添加于選擇培養(yǎng)基，抑制雜菌生長，降低分離培養(yǎng)假陰性率[9]。本研究以分離自牛子宮內(nèi)膜炎的致病性鏈球菌為宿主，分離鏈球菌毒性噬菌體，研究其主要生物學(xué)特性，為更深入研究和應(yīng)用鏈球菌噬菌體提供資料。

1 材料與方法

1.1 菌株 宿主菌鏈球菌48株，由本實驗室分離自患子宮內(nèi)膜炎的奶牛子宮；指示菌S-1株、S-2株、S-3株、S-4株、S-5株、S-6株、S-7株、S-8株、S-9株、S-10株鏈球菌，由本實驗室分離鑒定并保存。

1.2 主要試劑與儀器 DNaseI、RNaseA，均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；限制性內(nèi)切酶，購自寶生物工程(大連)有限公司；TSA、TSB培養(yǎng)基，購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；上層TSB培養(yǎng)基(含0.75%瓊脂)、下層TSA培養(yǎng)基、2×TSB培養(yǎng)液按說明書配制；SM液按《分子克隆實驗指南》(第3版)[10]附錄1配制。Himac CP100MX超速離心機由日立公司生產(chǎn)；TEM-100CX透射電鏡由TEOLLTD公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 宿主菌的準備 取凍存的宿主菌在TSA平板上劃線培養(yǎng)，次日取單菌落于5 mL TSB培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min 振搖培養(yǎng)。

1.3.2 噬菌體的分離、純化 以鏈球菌懸液為宿主，用2×TSB作濃縮培養(yǎng)基，以從長春市某處新采集的污水為樣品，參考文獻[11]中材料與方法3，37 ℃ 分離噬菌體，重復(fù)增殖5次，12 000 r/min離心15 min，細菌濾器過濾得擬含鏈球菌噬菌體的原液。

點滴法驗證：將100 μL過夜培養(yǎng)的鏈球菌(濃度約1.0×106CFU/mL)于TSA平板上涂勻，靜置20 min，滴加噬菌體原液5 μL，陰性對照組滴加等量生理鹽水，37 ℃培養(yǎng)12 h后觀察。

雙層平板法純化噬菌體：參考文獻[11]中材料與方法5進行，略有改動。

1.3.3 噬菌體的電鏡觀察 取適當稀釋噬菌體，經(jīng)雙層平板培養(yǎng)成噬菌斑網(wǎng)，加入3 mL SM液，4 ℃冰箱中振蕩10 h，吸出噬菌體液，12 000 r/min離心20 min，取上清30 μL滴于銅網(wǎng)上，靜置30 s，2%磷鎢酸負染90 s，晾干，透射電鏡觀察。

1.3.4 噬菌體基因組酶切分析 參考文獻[10]中從大規(guī)模培養(yǎng)物提取λ噬菌體基因組方法得噬菌體核酸，分別用BlnⅠ、EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、NcoI和Xhol I將核酸在適宜溫度下酶切10 h，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切片段。

1.3.5 噬菌體效價測定及裂解譜分析 用TSB培養(yǎng)基將噬菌體原液10倍梯度稀釋，將100 μL宿主菌液、氯化鈣和100 μL適當稀釋的噬菌體混勻，靜置，移入50 ℃保溫的半固體培養(yǎng)基，鋪雙層平板，37 ℃培養(yǎng)12 h，記噬菌斑數(shù)。噬菌體效價(PFU/mL)=平均噬菌斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。

點滴法分析噬菌體裂解譜：將10株指示菌(106CFU/mL)各100 μL分別均勻涂于TSA培養(yǎng)基表面，室溫靜置30 min后，滴加5 μL純化噬菌體液，吸收5 min，37 ℃培養(yǎng)過夜，觀察細菌、噬菌體生長情況。

1.3.6 氯仿、乙醚敏感性測定 (1)氯仿敏感性測定：將50 μL氯仿與950 μL噬菌體液(6.2×108PFU/mL)混勻，對照組不加氯仿，4 ℃冰箱孵育過夜，測噬菌體效價。(2)乙醚敏感性測定：將200 μL 乙醚與800 μL噬菌體液(6.2×108PFU/mL)混勻，對照組不加乙醚，冰浴振蕩1 h，3 000 r/min離心15 min，測噬菌體效價。

1.3.7 噬菌體的熱穩(wěn)定性與酸堿穩(wěn)定性測定 設(shè)8個不同水浴溫度，在每個溫度下放1支裝有1 mL新擴增噬菌體液的1.5 mL EP管，分別作用20、40 min 和60 min，取出冷卻至室溫，測效價。

用1.5 mL滅菌EP管分裝900 μL pH 2～13的TSB培養(yǎng)基，37 ℃水浴預(yù)熱30 min，在各離心管中分別加入100 μL噬菌體液，混勻，繼續(xù)放置3 h，取出置室溫下測效價。

1.3.8 最佳感染復(fù)數(shù)測定 取對數(shù)期宿主菌，適當稀釋噬菌體和宿主菌懸液，按表1加入等量噬菌體和宿主菌，37 ℃ 50 r/min振蕩培養(yǎng)5 h，4 ℃下12 000 r/min 離心30 min，取上清液，用雙層平板測各組效價，篩選最佳感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection，MOI)。

1.3.9 一步生長曲線繪制 按最佳MOI將宿主菌與噬菌體混勻，37 ℃水浴中孵育15 min，4 ℃、12 000 r/min 離心60 s，棄上清，用TSB洗滌沉淀2次，加入37 ℃預(yù)熱TSB培養(yǎng)基，37 ℃ 50 r/min振搖培養(yǎng)，每隔10 min取500 μL培養(yǎng)物，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清測噬菌體效價。以效價對數(shù)為縱坐標，以感染時間為橫坐標繪制一步生長曲線。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體分離純化 富集5次后，點滴法驗證結(jié)果表明，鏈球菌48株生長的TSA平板上滴加噬菌體原液處呈明顯噬菌現(xiàn)象，對照處菌苔正常，說明原液中含鏈球菌毒性噬菌體。經(jīng)反復(fù)純化，得空斑一致、清晰透亮、邊緣整齊的純化噬菌體(培養(yǎng)12 h)，命名為SP48。

2.2 噬菌體電鏡觀察 透射電鏡觀察到SP48呈蝌蚪狀復(fù)合對稱，頭部大小(79.0±0.33)nm×(73.0±0.38)nm，尾長(354±0.25)nm，屬于長尾噬菌體科(圖1)。

圖1 噬菌體SP48電鏡圖Fig.1 Electron micrograph of phage SP48

2.3 噬菌體基因組酶切分析 分別用BlnⅠ、EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、NcoⅠ、XholⅠ酶切，電泳發(fā)現(xiàn)，SP48含有EcoR Ⅰ、XholⅠ和BlnⅠ的酶切位點，表明噬菌體SP48核酸為雙鏈DNA。經(jīng)EcoR Ⅰ酶切可見7個條帶，經(jīng)XholⅠ酶切可見5個條帶，經(jīng)BlnI酶切可見3個條帶(圖2)，與Marker比對、計算可知噬菌體SP48的基因組大于60 kb。

圖2 噬菌體SP48基因組酶切電泳圖Fig.2 Enzyme digestion of phage SP48 genomeM：DL-15 000 marker；1：EcoR Ⅰ的酶切產(chǎn)物；2：BamH I的酶切產(chǎn)物；3：XholⅠ的酶切產(chǎn)物；4：BlnⅠ的酶切產(chǎn)物；5：NcoⅠ的酶切產(chǎn)物M：DL-15 000 marker；1：Products of EcoR Ⅰ digestion；2：Products of BamH I digestion；3：Products of XholⅠ digestion；4：Products of Bln Ⅰ digestion；5：Products of Nco Ⅰ digestion

2.4 噬菌體的效價測定及裂解譜分析 經(jīng)雙層平板法測得噬菌體SP48的效價為6.2×108PFU/mL。點滴法測定SP48的宿主譜，發(fā)現(xiàn)其僅裂解宿主菌鏈球菌48株，說明其特異性很強。

2.5 氯仿、乙醚敏感性試驗 乙醚、氯仿分別與噬菌體SP48作用后，測得效價分別為5.8×108PFU/mL和4.3×108PFU/mL，說明噬菌體SP48對乙醚和氯仿不敏感，推測其無囊膜。

2.6 噬菌體的熱穩(wěn)定性與酸堿穩(wěn)定性 SP48的熱穩(wěn)定性結(jié)果見中插彩版圖3，在40～45 ℃作用60 min 后的效價低于作用20 min和40 min的效價；50 ℃以下作用時間短于40 min時，對噬菌體感染性幾乎無影響；高于50 ℃作用60 min時，噬菌體效價明顯降低；60 ℃作用20 min噬菌體SP48完全失活。

圖3 噬菌體SP48的熱穩(wěn)定性Fig.3 Thermal stability of phage SP48

噬菌體SP48在pH 5～10的條件下效價變化不大(圖4)，在強酸或強堿環(huán)境下(pH≤4或≥12時)失活。

圖4 噬菌體SP48的pH穩(wěn)定性Fig.4 Stability of phage SP48 in different pH conditions

2.7 噬菌體的最佳MOI測定 當MOI為10時，噬菌體SP48的效價為2.6×109PFU/mL，在7個MOI中最高，為最佳MOI(表1)。

表1 噬菌體SP48最佳感染復(fù)數(shù)測定結(jié)果Table 1 Determination results of optimal multiplicity of infection of phage SP48

2.8 噬菌體的一步生長曲線 繪制噬菌體SP48的一步生長曲線(圖5)，發(fā)現(xiàn)SP48感染宿主菌后30 min 內(nèi)，噬菌體的效價變化不明顯，此時處于潛伏期；在感染后的30～110 min，噬菌體效價逐漸升高，為爆發(fā)期；隨后的40 min，噬菌體效價穩(wěn)定；根據(jù)公式爆發(fā)量=爆發(fā)結(jié)束時噬菌體效價/感染初期宿主菌濃度，得SP48爆發(fā)量約45 PFU/cell。

圖5 噬菌體SP48的一步生長曲線Fig.5 One-step growth curve of phage SP48

3 討論

已報道的鏈球菌噬菌體基因組均為dsDNA，大多屬長尾病毒科，一些屬短尾病毒科，罕見肌尾病毒科成員[12]。Harhala等[13]分離到2株化膿鏈球菌溶原性噬菌體Str01和Str03，尾長分別為186 nm、162 nm，基因組分別為37 030 bp和32 296 bp；柏琴琴等[14]以無乳鏈球菌為宿主從乳腺炎奶樣中分離出LYGO9、HZ04，從牛源無乳鏈球菌中誘導(dǎo)出溶原性噬菌體pA11，與該實驗室前期分離的JX01均為長尾噬菌體，推算4株噬菌體的基因組約38～45 kb。本研究從污水中分離到的鏈球菌噬菌體SP48也屬長尾噬菌體，基因組較前述鏈球菌噬菌體更大，尾更長。

關(guān)于鏈球菌噬菌體對環(huán)境抵抗力，Luo等[15]分離的無乳鏈球菌長尾噬菌體HN4對60～80 ℃和pH 3～5敏感；Harhala等[13]報道Str01、Str03在40 ℃下作用60 min 的存活率(88%、96%)低于作用15 min 的存活率(98%、100%)，在60 ℃下作用15 min 可保持15%、23%的存活率，作用60 min全被滅活；本研究分離到的SP48在40～60 ℃時隨作用時間延長和溫度升高，存活率也降低。Str01、Str03在pH=7時最穩(wěn)定，1 h存活率為92%、99%，5 h 存活率為83%、90%，在pH≤4或≥12環(huán)境下存活不超過1 h[13]；SP48在pH≤4或≥12時存活3 h以下。無乳鏈球菌噬菌體LYGO9的潛伏期僅5 min，爆發(fā)期25 min，平均爆發(fā)量30 PFU/細胞[14]；SP48較LYGO9的潛伏期、爆發(fā)期長，爆發(fā)量約為LYGO9的1.5倍，二者的殺菌能力有待試驗確定。

噬菌體有一定裂解譜，能跨種裂解的噬菌體較少，也是用噬菌體用于細菌性疾病治療的優(yōu)勢之一。鏈球菌噬菌體的裂解譜可能與宿主分型有關(guān)，Str01、Str03對37株A群鏈球菌的裂解率分別為13.5%、51%，對34株B群鏈球菌的裂解率分別為3%和0[13]；噬菌體LYGO9、HZ04、pA11、JX01可裂解的鏈球菌莢膜多糖分型以Ⅰa居多，但并非所有Ⅰa型無乳鏈球菌均被裂解，8株莢膜多糖Ⅱ型菌均不被裂解[14]。查濤等[16]發(fā)現(xiàn)，噬菌體phiYe-F10對O∶3小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的裂解率為84.5%，不裂解O∶5、O∶9血清型和其他菌株，而O抗原位于細胞壁脂多糖(LPS)外側(cè)，推測與噬菌體phiYe-F10的受體相關(guān)。本研究獲得的噬菌體SP48僅裂解宿主鏈球菌，不裂解10株指示菌，推測可能的原因為指示菌與宿主48株鏈球菌非同種或者非同型。