龐文帥，馬建蘇，劉曉麗，周麗霞，王博，王淼

（邢臺市人民醫(yī)院，河北 刑臺054031）

先天性巨結(jié)腸，又稱希爾施普龍?。╤irschsprungs disease,HD）是新生兒常見的先天性發(fā)育停頓疾病，發(fā)病率約為1/5 000，男性發(fā)病率高于女性，為4∶1[1]。病理變化主要是直腸、結(jié)腸神經(jīng)節(jié)細胞缺如，表現(xiàn)為新生兒出生后胎糞排出延遲、腹脹、結(jié)腸炎、低位性腸梗阻等，不僅影響患兒的生長發(fā)育，嚴重時還會危及患兒生命[2]。近年來流行病學(xué)調(diào)查顯示，HD 的發(fā)病率呈上升趨勢[3]，因此研究HD 的病因及機制對優(yōu)生優(yōu)育十分重要。目前HD 的病因和機制雖然尚未完全闡明，但隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)有的研究已明確顯示，HD 的發(fā)生與SOX-2、SOX-10、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell line-derived meurotrophic factor,GDNF）密切相關(guān)[4-5]。本研究運用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測SOX-2、SOX-10、GDNF 在HD 患兒狹窄段、擴張段、移行段腸管組織及非HD 患兒結(jié)腸中的表達情況，旨在闡明其在HD 中的作用，進一步探討HD 在分子基礎(chǔ)上的發(fā)病機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月—2019年8月邢臺市人民醫(yī)院手術(shù)治療的HD 患兒85 例作為HD 組，其中，男性71 例，女性14 例，年齡2 個月～7 歲，平均（3.7±0.6）歲?；純盒g(shù)后均經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診為HD。其中，常見型62 例，短段型23 例；患兒均無HD家族史，均為散發(fā)性，均未合并其他器官先天性畸形。取HD 患兒切除的狹窄段、擴張段、移行段組織作為HD 各腸段組，同期選取行結(jié)腸造瘺術(shù)的患兒20 例作為對照組，其中，男性16 例，女性4 例，年齡4 個月～6 歲，平均（3.9±0.7）歲，分別為先天性直腸肛管畸形16 例，肛門直腸損傷4 例。兩組患兒年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 顯微觀察及測量取HE 染色切片，觀察對照組、HD 組狹窄段、HD 組擴張段、HD 組移行段肌間神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)目，用顯微測量軟件測量腸肌間神經(jīng)叢直徑、神經(jīng)節(jié)細胞直徑、神經(jīng)節(jié)細胞質(zhì)/核，每張切片隨機采集3 個400 倍視野，錄入Excel 表格，計算各組平均值。

1.2.2 qRT-PCR取全層腸壁組織，棄去黏膜，用無菌生理鹽水沖洗后置于Ep 管中，于-80℃冰箱中保存。提取總RNA：檢測時取腸組織200 mg，加入1 ml Trizol 后置于冰水上的勻漿器中研磨，按說明書步驟提取總RNA。引物設(shè)計：采用Primer 5.0設(shè)計，SOX-2、SOX-10、GDNF引物序列見表1。

表1 SOX-2、SOX-10、GDNF引物序列

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA按Fermentas RT-PCR 試劑盒說明書操作步驟操作，對提取的mRNA 進行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為RNA 模版2 μl，Oligo（dT）1 μl，逆轉(zhuǎn)錄酶1 μl，5×Buffer 5 PL，dNTP 2 μl，Ribalock抑制劑1 μl，RNase free H2O 調(diào)整總體積至20 μl，GDNF 反應(yīng)條件為70℃預(yù)變性5 min，37℃變性5 min，42℃退火60 min，70℃延伸10 min，共32 個循環(huán)。SOX-2、SOX-10 反應(yīng)條件為65℃預(yù)變性5 min，42℃變性60 min，70℃退火10 min，共45 個循環(huán)。PCR 檢測：引物通過GenBank 查找SOX-2、SOX-10、GDNF 的mRNA 序列，計算機自動輸出每個cDNA 模版標(biāo)本的擴增曲線、CT 值和拷貝數(shù)。

1.3 觀察指標(biāo)

比較對照組、HD 組狹窄段、HD 組擴張段和HD 組移行段肌間神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)、肌間神經(jīng)叢直徑、神經(jīng)節(jié)細胞直徑、神經(jīng)節(jié)細胞質(zhì)/核；比較對照組、HD 組狹窄段、HD 組擴張段和HD 組移行段SOX-2、SOX-10、GDNF mRNA 的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腸肌間神經(jīng)叢直徑等相關(guān)指標(biāo)比較

各組肌間神經(jīng)叢直徑、神經(jīng)節(jié)細胞直徑、神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)、神經(jīng)節(jié)細胞質(zhì)/核比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。其中，腸肌間神經(jīng)叢直徑：HD 組狹窄段＜HD 組移行段＜HD 組擴張段和對照組；神經(jīng)節(jié)細胞直徑、神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)、神經(jīng)節(jié)細胞質(zhì)/核比：HD 組移行段＜HD 組擴張段和對照組。見表2。

表2 對照組與HD組各腸段肌間神經(jīng)叢直徑，神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)、直徑、質(zhì)/核情況 （±s）

表2 對照組與HD組各腸段肌間神經(jīng)叢直徑，神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)、直徑、質(zhì)/核情況 （±s）

注：HD組狹窄段神經(jīng)節(jié)細胞缺如。①與對照組比較，P ＜0.05；②與HD組擴張段比較，P ＜0.05。

組別對照組HD組擴張段HD組移行段HD組狹窄段F 值P 值n 20 85 85 85肌間神經(jīng)叢直徑/μm 58.67±11.72 57.13±10.86 34.28±7.63①②30.59±6.24 11.073 0.000神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)/個5.72±1.16 5.62±1.24 1.86±0.32①②-24.637 0.000神經(jīng)節(jié)細胞直徑/μm 16.57±3.61 16.02±3.52 11.82±2.76①②-19.286 0.000神經(jīng)節(jié)細胞質(zhì)/核2.33±0.43 2.20±0.51 1.60±0.33①②-29.763 0.000

2.2 各組SOX-2、SOX-10、GDNF mRNA 相對表達量比較

各組SOX-2、SOX-10、GDNF mRNA 相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較，HD 組狹窄段＜HD 組移行段＜HD 組擴張段和對照組（P＜0.05）。對照組與HD組擴張段比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 對照組與HD組各腸段SOX-2、SOX-10、GDNF mRNA的相對表達量比較 （±s）

表3 對照組與HD組各腸段SOX-2、SOX-10、GDNF mRNA的相對表達量比較 （±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與HD組擴張段比較，P ＜0.05；③與HD組移行段比較，P ＜0.05。

組別對照組HD組擴張段HD組移行段HD組狹窄段F 值P 值n 20 85 85 85 SOX-2 mRNA 33.69±7.85 32.84±6.29 31.13±7.05①②30.04±5.42①②③9.672 0.000 SOX-10 mRNA 1.34±0.28 1.33±0.36 1.30±0.34①②1.08±0.26①②③8.054 0.000 GDNF mRNA 1.31±0.21 1.19±0.18 0.89±0.13①②0.68±0.11①②③11.072 0.000

3 討論

HD 是常見的先天性畸形之一,有研究顯示，HD 的病因與腸神經(jīng)嵴細胞遷移形成腸神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system,ENS）的過程異常有關(guān)[6-8]。ENS 由致密的神經(jīng)纖維將特殊的膠質(zhì)細胞和神經(jīng)節(jié)細胞相互連接,組成一個獨立完整的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，對腸道的血液循環(huán)、蠕動、吸收等進行調(diào)節(jié)[9]。本研究運用顯微測量的方法測量對照組，HD 組狹窄段、擴張段和移行段肌間神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)、肌間神經(jīng)叢直徑、神經(jīng)節(jié)細胞直徑、神經(jīng)節(jié)細胞質(zhì)/核，結(jié)果顯示，腸肌間神經(jīng)叢直徑：HD 組狹窄段＜HD組移行段＜HD 組擴張段和對照組；神經(jīng)節(jié)細胞直徑、神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)、神經(jīng)節(jié)細胞質(zhì)/核：HD 組移行段＜HD 組擴張段和對照組。說明HD 患兒部分腸段神經(jīng)節(jié)細胞缺如，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育停頓,但原因迄今未明。

Dom SOX-10是雜合子動物中唯一被認識的產(chǎn)生致死性ENS 表型的突變基因，其可改變正常讀碼框，導(dǎo)致一種截斷的蛋白產(chǎn)物[10-11]。近年來動物實驗研究證實，在顯性巨結(jié)腸突變大鼠中SOX-10基因缺乏，導(dǎo)致ENS 發(fā)育停頓，可能是神經(jīng)嵴細胞突變后在移行早期過量死亡所致[12-14]。由此可見SOX-10基因可能參與腸神經(jīng)元的發(fā)育。本研究結(jié)果顯示，各組SOX-10 mRNA 相對表達量有差異。其中HD 組狹窄段SOX-10 mRNA 相對表達量低于HD 組移行段；HD 組狹窄段和移行段均低于HD 組擴張段和對照組。對照組、HD 組擴張段SOX-10 mRNA 的相對表達量無差異。說明SOX-10 mRNA在病變腸段中表達逐漸減少，特別是在無神經(jīng)節(jié)細胞的狹窄腸段中表達減少得更加明顯，分析原因由于狹窄腸管內(nèi)缺乏正常表達SOX-10 mRNA 的肌間神經(jīng)節(jié)細胞，可能在HD 患兒腸管狹窄段中存在能被SOX-10 處理的乙酞膽堿醋酶受體或神經(jīng)營養(yǎng)因子，從而刺激無神經(jīng)節(jié)細胞腸管中的其他興奮性神經(jīng)纖維生長，致神經(jīng)纖維異常增生引起腸管狹窄痙攣和腸功能障礙[15-17]。同時也說明SOX-10可能是維持腸神經(jīng)功能的重要基因。

SOX-2 分子量約為35 kD，是多潛能性干細胞標(biāo)志物，其轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域為C 末端，包含一段富含核苷酸的序列，SOX-2與SOX-10一樣，均為SOX基因家族成員。近年來研究發(fā)現(xiàn)，不僅在生殖細胞、胚胎干細胞中表達，而且在正常腸道神經(jīng)嵴細胞、膠質(zhì)細胞衍生物中均廣泛表達[18-20]，并參與廣泛的發(fā)育調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果顯示，SOX-2 mRNA相對表達量為狹窄段＜移行段＜擴張段。原因可能為SOX-2 呈低表達時，不能很好地發(fā)揮發(fā)育調(diào)節(jié)作用，所以導(dǎo)致腸管狹窄。GDNF 是轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）2B 超家族的新亞族，是REX 的配基之一[21-23]。既往研究認為GDNF 的突變不足以引發(fā)HD，但近年來研究發(fā)現(xiàn)，REX 基因突變是HD 眾多基因突變之一[18]。GDNF 對胃腸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、周圍自主神經(jīng)、感覺神經(jīng)等多種神經(jīng)元均有營養(yǎng)和保護作用，與多種神經(jīng)元的分化和生存支持有關(guān)[24]。胡曉麗等[25]應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測HD 患兒狹窄段、移行段和擴張段GDNF 分布，結(jié)果顯示狹窄段GDNF 分布明顯少于移行段和擴張段。本研究從轉(zhuǎn)錄水平研究HD 患兒不同腸段GDNF mRNA 的表達，結(jié)果顯示，狹窄段＜移行段＜擴張段。與胡曉麗等結(jié)果基本相符，提示SOX-2、GDNF、SOX-10 可能參與了ENS 發(fā)育。

綜上所述，HD 的發(fā)生可能與多種基因一起導(dǎo)致病變腸段SOX-2、SOX-10等基因突變后，SOX-2、SOX-10、GDNF 表達減少有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，HD患兒病變腸管組織SOX-2、SOX-10、GDNF mRNA 相對表達量擴張段、移行段、狹窄段逐漸降低，說明SOX-2、SOX-10、GDNF可能是維持腸神經(jīng)系統(tǒng)功能正常的必要基因，如果上述基因表達降低，則可能引起腸管狹窄出現(xiàn)功能障礙，但上述基因在HD 發(fā)生中的作用尚有待進一步研究。