常樂樂，王思源，竇樂，賈蒙，王騰飛，胥冰

（陜西中醫(yī)藥大學(xué)1.臨床醫(yī)學(xué)系，2.醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，陜西 咸陽712000）

近年來，藥物性肝損傷（drug-induced liver injury,DILI）是臨床上較為常見的急性肝衰竭的主要病因，其危害僅次于病毒性肝炎、脂肪肝。據(jù)WHO 近期統(tǒng)計(jì)，每年發(fā)生率約20/10 萬人，病死率已經(jīng)躍居世界第五。然而，目前DILI 的預(yù)測及診斷相對(duì)困難，缺乏效果好的治療方法[1]。對(duì)乙酰氨基苯酚（Acetaminophen,APAP）是目前臨床上常用的解熱鎮(zhèn)痛類藥物，長時(shí)間大劑量服用APAP 可致DILI[2]?？鄥A（KSJ）是提取于豆科植物苦參的干燥根、植株、果實(shí)的一種生物堿，具有多種重要的藥理作用，如抗炎、抗纖維化、抗腫瘤、抗病毒等[3]。目前，KSJ 已被廣泛應(yīng)用于多種肝臟疾病和惡性腫瘤的治療中[4]，其對(duì)APAP 所致肝損傷的保肝效果尚未見報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)以APAP 誘導(dǎo)的小鼠急性藥物性肝損傷為模型，研究KSJ 對(duì)急性DILI的保護(hù)作用及機(jī)制，為臨床預(yù)防和治療DILI 提供一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40 只健康成年C57BL/6 小鼠，雄性，體重（20±2）g，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK（陜）2017-003。飼養(yǎng)室溫度（24±1）℃，濕度40%～80%。實(shí)驗(yàn)開始前，動(dòng)物需飼養(yǎng)1 周左右以適應(yīng)環(huán)境。

1.2 藥物與試劑

注射用KSJ（山東瑞陽制藥股份有限公司，批號(hào)：H20040171）；對(duì)乙酰氨基苯酚（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：M00118008）；10%葡萄糖注射液（濟(jì)寧辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：1306251360）；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒（批號(hào)：20180612）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒（批號(hào)：20180602）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號(hào)：20180608）及丙二醛（MDA）試劑盒（批號(hào)：20180603）購自南京建成生物研究所；小鼠血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒、白細(xì)胞介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒購自研域（上海）生物科技有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

DQP-9010 型石蠟冷凍切片機(jī)（上海華巖儀器設(shè)備有限公司），精密電子天平（上海舜宇恒平有限責(zé)任公司），高速冷凍離心機(jī)（無錫昊特斯科技有限公司），全自動(dòng)酶標(biāo)儀[華泰和合（北京）商貿(mào)有限公司]。

1.4 分組及給藥

小鼠適應(yīng)環(huán)境1 周后，隨機(jī)取40 只健康成年C57BL/6 小鼠分為空白對(duì)照組、APAP 組、KSJ 大劑量組、KSJ 中劑量組和KSJ 小劑量組，每組8 只。KSJ 小、中、大劑量組小鼠參考相關(guān)文獻(xiàn)[5]分別尾靜脈注射KSJ 0.7 mg/（kg·d）、1.4 mg/（kg·d）、2.8 mg/（kg·d），給藥10 ml/kg，連續(xù)注射7 d，KSJ 用10%葡萄糖溶液配制。空白對(duì)照組、APAP 組小鼠注射等劑量溶媒（10%葡萄糖溶液10 ml/kg）7 d。末次給藥后1 h，除空白對(duì)照組外其他各組小鼠一次性腹腔注射APAP 400 mg/kg，復(fù)制APAP 小鼠急性藥物性肝損傷模型[6]?？瞻讓?duì)照組小鼠則一次性腹腔注射等量生理鹽水。禁食不禁水24 h。

1.5 標(biāo)本采集與檢測

1.5.1 小鼠血清AST、ALT 活力檢測對(duì)乙酰氨基酚處理24 h 后，小鼠摘除眼球取血，37℃靜置1 h，于離心機(jī)5 000 r/min 離心10 min，取上清液，用PBS 稀釋10 倍，檢測AST、ALT 活力。

1.5.2 小鼠肝臟MDA、SOD 含量檢測眼球取血后，立即處死小鼠，取出小鼠肝臟后加生理鹽水制成10%的肝勻漿，按照試劑盒說明書操作，于酶標(biāo)儀450 nm 波長處讀取各孔的吸光度值并記錄，檢測肝組織中MDA、SOD 活性。

1.5.3 小鼠血漿TNF-α和IL-6水平檢測取出冷凍血漿樣品，恢復(fù)至室溫，混勻，常溫下離心機(jī)5 000 r/min 離心5 min，取上清液50 μl，按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測血漿中TNF-α 和IL-6 的水平。操作完成后30 min 內(nèi)，于酶標(biāo)儀450 nm 波長處讀取各孔的吸光度值并記錄。最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算對(duì)應(yīng)樣品的濃度。

1.5.4 小鼠肝臟病理學(xué)檢查10%甲醛固定小鼠肝臟，24 h 后梯度酒精脫水，二甲苯透明，常規(guī)浸蠟包埋，制片，HE 染色。觀察肝臟組織病理變化。

1.5.5 免疫組織化學(xué)染色檢測小鼠肝臟TNF-α 和IL-6 表達(dá)切片常規(guī)脫蠟，各級(jí)濃度酒精水化，抗原修復(fù)（微波修復(fù)），冷卻至室溫。滴加山羊血清封閉液，37℃恒溫箱放置30 min，加稀釋（1∶200）的一抗（TNF-α、IL-6），4℃冰箱過夜。PBS 洗片5 min×3 次，加二抗后，37℃恒溫箱放置30 min，PBS 洗片5 min×3 次，滴加ABC 復(fù)合物50 μl，37℃恒溫箱放置30 min，PBS 洗片5 min×3 次。每張切片加1 滴DAB 液顯色20 min，蘇木素復(fù)染60 s，各級(jí)濃度酒精快速脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡觀察。陰性對(duì)照用PBS 代替一抗（TNF-α、IL-6），其他步驟相同。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用秩和檢驗(yàn)（H檢驗(yàn)）或方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠血清AST和ALT活力比較

各組小鼠血清AST 和ALT 活力比較，經(jīng)秩和檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。APAP 組AST、ALT 活力較空白對(duì)照組增強(qiáng)（P＜0.05）；APAP 組AST、ALT 活力與KSJ 小劑量組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；KSJ 中、大劑量組AST、ALT 活力較APAP 組降低（P＜0.05）；KSJ 小、中、大劑量組間AST、ALT 活力兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且呈劑量依賴性。見表1。

表1 小鼠血清AST、ALT活力比較 （n=8，u/L，±s）

表1 小鼠血清AST、ALT活力比較 （n=8，u/L，±s）

注：①與空白對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與APAP 組比較，P ＜0.05；③與KSJ小劑量組比較，P ＜0.05；④與KSJ中劑量組比較，P ＜0.05。

組別空白對(duì)照組APAP組KSJ小劑量組KSJ中劑量組KSJ大劑量組H 值P 值A(chǔ)ST 39.74±8.16 8 123.71±262.22①8 002.77±138.32 5 563.01±126.61②③2 295.62±553.09②③④12.900 0.012 ALT 35.97±9.20 8 065.28±257.95①7 926.69±143.22 6 107.02±547.94②③2 579.00±510.68②③④13.033 0.011

2.2 小鼠肝臟MDA和SOD含量的比較

各組小鼠肝臟MDA和SOD含量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。APAP 組MDA 含量較空白對(duì)照組升高（P＜0.05），SOD 含量降低（P＜0.05）；KSJ 小、中、大劑量組MDA 含量較APAP 組下降（P＜0.05），SOD 含量升高（P＜0.05）；KSJ 小、中、大劑量組間MDA 和SOD 含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且呈劑量依賴性。見表2。

表2 小鼠肝臟MDA、SOD含量比較 （n=8，±s）

表2 小鼠肝臟MDA、SOD含量比較 （n=8，±s）

注：①與空白對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與APAP 組比較，P ＜0.05；③與KSJ小劑量組比較，P ＜0.05；④與KSJ中劑量組比較，P ＜0.05。

組別空白對(duì)照組APAP組KSJ小劑量組KSJ中劑量組KSJ大劑量組F 值P 值MDA/（nmol/mg)3.04±0.38 12.23±2.52①6.84±0.60②5.45±0.29②③4.35±0.61②③④26.337 0.000 SOD/（u/mg)422.93±22.84 246.74±37.28①303.03±4.01②328.29±5.59②③360.92±33.02②③④21.055 0.000

2.3 小鼠血清TNF-α和IL-6水平比較

各組小鼠血清TNF-α 和IL-6 水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。APAP 組TNF-α 和IL-6 水平較空白對(duì)照組升高（P＜0.05）；KSJ 小、中、大劑量組TNF-α 和IL-6 水平較APAP組降低（P＜0.05）；KSJ 小、中、大劑量組間TNF-α和IL-6 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且呈劑量依賴性。見表3。

表3 小鼠血清TNF-α、IL-6水平比較（n=8，pg/ml，±s）

表3 小鼠血清TNF-α、IL-6水平比較（n=8，pg/ml，±s）

注：①與空白對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與APAP 組比較，P ＜0.05；③與KSJ小劑量組比較，P ＜0.05；④與KSJ中劑量組比較，P ＜0.05。

組別空白雙井組APAP組KSJ小劑量組KSJ中劑量組KSJ大劑量組F 值P 值TNF-α 246.57±51.62 478.64±60.24①431.59±52.60②327.46±38.23②③249.39±44.31②③④13.093 0.001 IL-6 83.34±26.84 215.68±47.77①203.49±33.54②159.64±14.78②③90.23±11.89②③④12.809 0.001

2.4 小鼠肝組織病理變化

各組小鼠肝臟大體病理變化肉眼觀，空白對(duì)照組小鼠肝臟外觀呈紅褐色，表面光滑，質(zhì)軟，大小形態(tài)正常未見變性和壞死；APAP 組小鼠肝臟損傷明顯，體積變大，表面有點(diǎn)狀充血、變性和壞死；KSJ 小、中、大劑量組小鼠肝臟變性和壞死程度明顯較APAP 組減輕，且KSJ 大劑量組效果更明顯。見圖1。

圖1 各組小鼠肝組織病理變化

各組小鼠肝臟鏡下病理變化光鏡下，空白對(duì)照組肝細(xì)胞核排列規(guī)整，清晰可見肝小葉結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞索呈放射狀排列；APAP 組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肝細(xì)胞有不同程度的壞死和變性，肝細(xì)胞漿中出現(xiàn)大小各異的圓形空泡，中央靜脈淤血；與APAP 組比較，KSJ 小、中、大劑量組可見肝細(xì)胞的壞死和變性程度有不同程度的減輕，其中以大劑量組的改善作用最為明顯。見圖2。

圖2 光鏡下各組小鼠肝組織病理變化 （HE染色×400）

2.5 各組小鼠肝臟TNF-α和IL-6的表達(dá)

各組小鼠肝臟免疫組織化學(xué)染色檢測結(jié)果見圖3、4。以細(xì)胞胞質(zhì)中有明顯的棕黃色顆粒作為TNF-α、IL-6 陽性表達(dá)判定?？瞻捉M肝細(xì)胞核排列規(guī)整，清晰可見肝小葉結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞索呈放射狀排列，肝臟中僅有少量TNF-α、IL-6 表達(dá)。相比空白組，APAP 組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肝細(xì)胞有不同程度的壞死和變性，肝臟中TNF-α、IL-6 表達(dá)水平升高；與APAP 組比較，KSJ 小、中、大劑量組可見肝細(xì)胞壞死和變性有不同程度減輕，肝臟中TNF-α、IL-6 表達(dá)水平逐級(jí)下降，其中以大劑量組的下降最為明顯。

圖3 各組小鼠肝臟TNF-α的表達(dá) （免疫組織化學(xué)×400）

圖4 各組小鼠肝臟IL-6的表達(dá) （免疫組織化學(xué)×400）

3 討論

肝臟是人體和動(dòng)物最重要的代謝場所，許多重要的化學(xué)反應(yīng)都在肝臟進(jìn)行，也是體內(nèi)重要的解毒和合成器官，所以易遭受各種藥物和代謝產(chǎn)物的損傷[7]。

DILI 是目前臨床常見的一種藥物源性疾病，引起DILI 最常見的藥物是APAP。在疾病早期，可通過停止使用致肝損傷藥物并服用保肝藥物恢復(fù)肝臟功能，如果未及時(shí)發(fā)現(xiàn)并積極治療，可發(fā)展為急性肝損傷。近年來，中藥在藥物性肝損傷的治療中發(fā)揮著獨(dú)特優(yōu)勢。本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制APAP 所致小鼠急性藥物性肝損傷模型，進(jìn)而探究KSJ 對(duì)藥物性肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

DILI 的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，通過對(duì)其機(jī)制的研究可以為臨床預(yù)防和治療藥物性肝損傷提供更多的可能性。肝細(xì)胞的壞死、凋亡幾乎貫穿于所有肝臟疾病中，不同的是誘發(fā)其凋亡的機(jī)制存在特異性差異[8-10]。目前的研究發(fā)現(xiàn)[11-13]，DILI的發(fā)生是多種因素共同作用的結(jié)果，包括藥物的直接毒性損害、特異質(zhì)肝毒性、線粒體功能損傷、炎癥反應(yīng)等。

AST 和ALT 絕大部分分布在肝細(xì)胞內(nèi)，只有小部分存在于肌細(xì)胞中。所以當(dāng)肝臟受損時(shí)，肝細(xì)胞膜遭到破壞，AST 和ALT 便進(jìn)入血液，使得血液中AST 和ALT 含量升高，因此AST 和ALT 可作為評(píng)價(jià)肝臟生理功能的重要指標(biāo)[14]。KSJ 組小鼠血清AST 和ALT 含量較APAP 組降低，這表明KSJ 在一定程度上減輕APAP 所致小鼠藥物性肝損傷程度。

體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的最終代謝產(chǎn)物是MDA，所以MDA 可以反映脂質(zhì)過氧化物指標(biāo)和肝細(xì)胞損傷的程度[15]。SOD 是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)中較為關(guān)鍵的酶，其活性降低時(shí)，機(jī)體內(nèi)自由基含量就會(huì)上升，致使脂質(zhì)過氧化，進(jìn)一步損傷肝細(xì)胞[16]。本實(shí)驗(yàn)給予APAP 后APAP 組小鼠肝組織中MDA 含量明顯提高，SOD 活性明顯下降，說明小鼠抗氧化系統(tǒng)遭受嚴(yán)重破壞，肝組織發(fā)生氧化損傷，而給予KSJ 后MDA 含量較APAP 組有所下降，SOD 活性有所提高，其中KSJ 大劑量組作用更為明顯。

炎癥因子和氧自由基在肝損傷過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)[17-20]，TNF-α 和IL-6 是在APAP 誘導(dǎo)小鼠肝損傷中比較重要的炎癥因子，因此，TNF-α和IL-6 可以反映藥效和肝損傷程度[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，APAP 模型復(fù)制后TNF-α 和IL-6 水平明顯升高，經(jīng)過KSJ 治療的小鼠血清TNF-α 和IL-6 水平下降，說明KSJ 可以抑制炎癥因子TNF-α 和IL-6 的產(chǎn)生，保護(hù)APAP 所致肝損傷。HE 染色結(jié)果顯示KSJ組小鼠肝組織變性、壞死明顯減輕，說明KSJ 可以減輕炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞變性、壞死。

目前，DILI 的主要治療方法是停止使用可疑致肝損傷藥物。臨床藥物治療[22-24]主要包括N-乙酰半胱氨酸、雙環(huán)醇和甘草酸制劑等，但大多都是經(jīng)驗(yàn)用藥。糖皮質(zhì)激素療效尚不明確，需結(jié)合治療效果和有可能引起的不良反應(yīng)充分權(quán)衡后使用。對(duì)有嚴(yán)重并發(fā)癥的患者，可考慮進(jìn)行肝移植。KSJ 生物活性廣泛，具有抗炎、抗纖維化、抗腫瘤和抗病毒等多重藥理作用[3]。臨床已被用于治療各種肝臟疾病。趙巖[25]指出，KSJ 可以降低四氯化碳（CCL4）所致大鼠肝損傷的ALT、AST、IL-6 和TNF-α 水平，減輕肝臟炎癥細(xì)胞浸潤和肝細(xì)胞損傷程度。吳洋等[26]指出，KSJ 可能通過抗氧化作用保護(hù)肝細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，KSJ 可以降低血清ALT 和AST 水平、降低MDA 含量，提高SOD 活力，以及減輕肝臟病理損傷和肝細(xì)胞凋亡程度。同時(shí)對(duì)APAP 誘導(dǎo)產(chǎn)生的TNF-α 和IL-6 具有抑制作用，并且其效果呈劑量依賴性。

綜上所述，KSJ 對(duì)APAP 誘導(dǎo)的小鼠DILI 具有良好的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抗炎抗氧化和抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)，因此，KSJ 可作為DILI 肝損傷治療的候選藥，為臨床治療DILI 和探討其發(fā)病機(jī)制提供了一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。