周建光， 單連標， 周穎奇， 季興英， 楊 鳴， 王廣勇， 劉長云△

(1. 海軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院虹口院區(qū)神經(jīng)內(nèi)科, 2. 消化內(nèi)科, 上海 200081)

平時外環(huán)境正常大氣壓壓力為101.3 KPa(760 mmkg)，由于種種原因外環(huán)境空氣壓力降低，一般見于高海拔地區(qū)，可以引起高原反應等[1]。在特殊情況下如潛艇、太空失事，周圍空氣壓力會快速下降，可達真空即壓力為0 atm，甚至負壓狀態(tài)。我國潛艇部隊已將快速上浮脫險作為艇員脫險的主要方案之 一，上浮過程中，人體外部水壓會迅速下降，如果因涌浪、漩渦、操 作不當?shù)仍驎斐煽焖贉p壓，以往研究報道快速減壓后可引起肺組織出血、水腫、肢體癱瘓、甚至是死亡等[2～3]。

快速減壓對機體的損傷目前研究還較少，但是這一特殊環(huán)境變化，以及引起的事故可能日漸增多，對這方面的研究也是愈來愈必要。查閱文獻快速減壓對血腦屏障影響的研究尚未見報道。多種腦損傷后引起腦水腫，其機制之一是因釋放基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo proteinases, MMPs)中的明膠酶 (MMP-9) 等代謝產(chǎn)物，嚴重破壞腦毛細血管基底層，導致血腦屏障的直接破壞[4]。本研究擬模擬快速減壓失事后觀察血腦屏障以及MMP-9 mRNA的變化，為有效治療快速減壓腦損傷提供理論依據(jù)，其意義是保護特殊環(huán)境作業(yè)人員防止這種損傷以及發(fā)生后可以積極有效治療。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康雄性成年SD大鼠48只，由海軍特色醫(yī)學中心動物中心提供，體質(zhì)量210～300 g，自然光照，隨意飲食，觀察和檢疫一周正常后進行實驗。用隨機數(shù)字法隨機分為4組，每組12只動物：正常對照組(A組)：動物置于減壓艙內(nèi)，不施加減壓；快速減壓6 h組(B組)、快速減壓24h組(C組)和快速減壓48 h組(D組)：減壓處理后6 h、24 h、48 h斷頭取材。每組各取大鼠4只分別用于腦含水量、 RT-PCR測定、腦組織伊文藍(Evan Blue, EB)測定。

1.2 快速減壓的處理[2]

大鼠置于減壓艙(內(nèi)徑0.3 m、長0.6 m、艙容積0.042 m3)，關閉艙門后同時開動真空泵，抽氣速度為5 L/s，持續(xù)抽艙內(nèi)空氣2 min，使艙內(nèi)壓力降至20 KPa，然后維持此艙壓10 min，觀察大鼠行為變化，之后關閉真空泵，打開艙進氣閥，緩慢1 min艙內(nèi)復壓，開艙門取出大鼠。根據(jù)不同處理的組別分別進行相應的處理。

1.3 腦含水量測定[5]

取大鼠腦海馬和半球后，吸干表面水分及血漬，稱取濕重，放入電熱恒溫干燥箱內(nèi)，100℃烤24 h至恒重，稱取干重。根據(jù)Eliot公式：腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%，計算腦組織含水量。

1.4 EB測定

參考文獻[1]各組大鼠處死前l(fā) h經(jīng)尾靜脈注射2%EB生理鹽水(l ml/kg)，處死后大鼠置于冰盤中取海馬和半球，分別加入3 ml甲酞胺，加蓋于45℃水浴箱孵育48 h，輕輕搖，離心15 min(3 000 r/min)，取上清液采用分光光度計色(波長為623 nm)。根據(jù)標準曲線求EB含量。

1.5 RT-PCR檢測腦組織MMP-9 mRNA的表達

每組取4只大鼠海馬、半球組織采用總RNA抽提試劑盒Trizol? Reagent (Gibco公司生產(chǎn)) 抽提大鼠海馬半球組織總RNA，-80℃保存。參閱文獻[5]進行RT-PCR反應過程。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 快速減壓后不同時間海馬和半球含水量變化

快速減壓后6 h與對照組比較，半球含水量增加(P> 0.05 )，海馬含水量增加 (P<0.01)；快速減壓后24 h和48 h與對照組比較，半球和海馬含水量均增加 (P<0.05,P< 0.01)；快速減壓后24 h、48 h與6 h組比較，半球含水量增加 (P<0.05,P<0.01)；快速減壓后24 h與6 h組比較，海馬含水量增加 (P<0.05)；快速減壓后48 h與6 h組比較，海馬含水量增加 (P>0.05)；快速減壓后48 h與24 h組比較，半球含水量減少(P>0.05)，海馬含水量減少 (P<0.05)?？焖贉p壓后6 h和24 h海馬與半球比較，含水量均增加 (P< 0.05,P<0.01)；快速減壓后48 h海馬與半球比較，含水量增加(P>0.05，表1)。

Tab. 1 Changes of water content after rapid decompression (%, n=4)

2.2 快速減壓后不同時間海馬和半球EB含量變化

快速減壓后6 h 、24 h和48 h與對照組比較半球和海馬EB均增加(P<0.05,P<0.01)；快速減壓后24 h和48 h與6 h組比較半球和海馬EB均增加 (P<0.05,P<0.01)；快速減壓后48 h與24 h組比較半球EB減少 (P>0.05)，海馬EB明顯減少 (P<0.05)?？焖贉p壓后6 h、24 h和48 h海馬與半球比較，EB均增加 (P<0.05,P<0.01, 表2)。

Tab. 2 Changes of EB after rapid decompression (μg/g， n=4)

2.3 快速減壓后不同時間海馬和半球MMP-9 mRNA表達變化

快速減壓后6 h 、24 h和48 h與對照組比較，半球和海馬MMP-9 mRNA均增加 (P<0.05,P<0.01)；快速減壓后24 h與6 h組比較，半球和海馬MMP-9 mRNA均增加 (P< 0.05,P<0.01)；快速減壓后48 h與6 h組比較，半球MMP-9 mRNA減少(P>0.05)，海馬MMP-9 mRNA增加 (P<0.05,P<0.01)；快速減壓后48 h與24 h組比較，半球和海馬MMP-9 mRNA均減少 (P<0.05)?？焖贉p壓后6 h、24 h和48 h海馬與半球比較，MMP-9 mRNA均增加 (P<0.05,P< 0.01, 表3)。

Tab. 3 Changes of MMP-9mRNA after rapid decompression

2.4 相關性分析

快速減壓24 h后海馬、半球含水量與EB(r=0.514,P<0.05)、與MMP-9 mRNA(r=0.575,P<0.05)呈正相關，快速減壓24 h后海馬、半球EB與MMP-9 mRNA(r=0.796,P< 0.01)呈正相關。

3 討論

李慈等[2]研究結果表明，新西蘭兔由常壓減至18 KPa以下全部死亡，而在20 KPa以上時全部存活，大鼠則對快速減壓耐受力較強，其死亡臨界點約為6 KPa，因此本實驗采用大鼠減壓至20 KPa的非致死性損傷模型，觀察其對腦組織的損傷作用。這種快速減壓對機體的損傷存在減壓及缺氧因素，這兩種因素都容易造成腦損傷[1]。眾所周知，腦內(nèi)海馬與半球不同，對損傷特別是缺氧極度敏感。本實驗結果也表明快速減壓后大鼠海馬以及半球含水量均增加，引起不同程度的腦水腫。從不同時間點的結果分析，海馬腦水腫6 h明顯增加、24 h達峰、48 h下降，而半球6 h不明顯、24 h達峰、48 h下降不明顯，也說明腦內(nèi)不同組織結構對快速減壓損傷的敏感性不同，海馬是敏感組織。結果提示快速減壓對腦組織的損傷具有選擇易損性，不同組織損傷敏感性不同，海馬是管理記憶的重要腦回，其易損導致記憶力受損，可以引起認知功能下降，重度則會導致癡呆。

腦功能的維持主要靠血腦屏障的完整，血腦屏障是由毛細血管內(nèi)皮、基膜以及神經(jīng)膠質(zhì)膜組成的血液和腦組織之間具有選擇通透性功能的屏障，維持腦組織內(nèi)環(huán)境的動態(tài)平衡。正常情況下，水分子和小分子的脂溶性物質(zhì)可通過，一旦破壞，有害物質(zhì)及大分子的蛋白質(zhì)等則從血液中進入腦組織，引起腦水腫，進而進一步引起神經(jīng)元的死亡[6～7]。本研究采用EB測定觀察不同腦組織的血腦屏障破壞的情況，結果證實快速減壓引起腦組織血腦屏障的破壞，不同部位不同時間的結果分析，其血腦屏障破壞的程度及時間變化趨勢與腦水腫的程度和變化趨勢相似，呈正相關關系，說明引起腦水腫的原因與血腦屏障的破壞有關，從不同部位EB變化結果表明海馬比半球對快速減壓血腦屏障損傷敏感，血腦屏障破壞造成血管源性腦水腫是導致快速減壓腦損傷的主要病理生理機制。這種血管源性腦水腫早期發(fā)現(xiàn)及時治療，可以減少繼發(fā)神經(jīng)元損傷，特別是海馬回的神經(jīng)元，對腦功能的保護具有重要意義。

研究表明MMP-9是金屬蛋白酶[8]，稱為明膠蛋白酶B，正常情況下，腦組織MMP-9極少表達，但病理情況下特別是腦缺血缺氧條件下MMP-9表達增加[4]，而MMP-9的過表達以及活化后作用于血管壁基膜和神經(jīng)膠質(zhì)膜，內(nèi)皮細胞通透性增加，從而破壞血腦屏障，是血腦屏障破壞的重要機制之一[9～10]。本研究表明，快速減壓引起不同腦組織的MMP-9過表達，同樣時間變化趨勢與血腦屏障破壞的程度和變化趨勢相似，呈正相關關系，說明血腦屏障破壞與MMP-9過表達有關，不同部位MMP-9變化結果顯示海馬MMP-9表達比半球更敏感。結果提示防止或者減少快速減壓腦損傷的措施之一就是能夠阻斷或減少MMP-9過表達，為進一步的研究提供思路。

綜上，快速減壓后可以引起大鼠不同腦組織中MMP-9的過表達，MMP-9活化引起血腦屏障的破壞，進而引起血管源性腦水腫，不同的腦組織對損傷的反應不同，具有選擇易損性，海馬回更敏感，可能引起記憶力下降等腦功能障礙。快速減壓引起血腦屏障的變化對臨床提供指導依據(jù)，防止血腦屏障損傷及血管源性腦水腫是防治快速減壓損傷的有力措施之一，特別是抑制MMP-9的過表達是防治快速減壓腦損傷的有效措施之一，為進一步的科研提供依據(jù)和思路。