孟天華， 孫曉慧， 李 樂△, 陶厚權(quán)

(1．浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院2018級研究生； 2. 浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院， 杭州 310014； 3. 浙江省人民醫(yī)院中心實驗室， 杭州 310014)

心肌細(xì)胞肥大(cardiomyocyte hypertrophy，CH)是心肌受激素水平變化或理化刺激時所產(chǎn)生的適應(yīng)性代償反應(yīng)。CH初期，心室壁增厚，心肌收縮功能改善，能保證正常心臟功能。但中后期，CH易導(dǎo)致心肌缺血、心律失常，最終誘發(fā)心力衰竭；，其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，己被列為引起心血管疾病發(fā)生率和死亡率顯著升高的獨(dú)立危險因素[1]。貝母屬植物及其提取物，在抗炎、抗腫瘤、降血壓、神經(jīng)保護(hù)、鎮(zhèn)痛、抗氧化等方面具有顯著的藥理活性，尤其是在抗炎方面的效果顯著[2]。但其對CH作用的研究，國內(nèi)外鮮有研究報道，本研究以離體培養(yǎng)心肌H9c2細(xì)胞為樣本，以異丙腎上腺素(isoprenaline，Iso)誘導(dǎo)CH，通過實驗觀察貝母提取物(fritillaria extract, FE)對Iso誘導(dǎo)CH的干預(yù)作用，旨為FE 將來用于臨床提供基礎(chǔ)實驗資料。

1 材料與方法

1.1 材料、藥物

大鼠心肌H9c2細(xì)胞株，中科院上海細(xì)胞生物所。 FE；批號 170309 ，浙江湖州康成生物公司， 生料比：10：1；Iso , 武漢遠(yuǎn)程科技公司，批號 170911；青霉素(批號 170512)、鏈霉素(批號 170314)，華北制藥廠；胎牛血清(FBS，批號 170212) 華美生物工程公司；DMEM培養(yǎng)基(批號 172318)，GIBCO產(chǎn)品；0.25%胰蛋白酶：華美生物工程公司；BCA 蛋白檢測試劑盒3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide/3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)，二甲基亞砜(DMSO)；結(jié)晶紫染液；中國江蘇碧云天生物技術(shù)公司；鈣-4試劑盒,美國MolecularDevices 公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要實驗儀器

Vicell 細(xì)胞計數(shù)儀(Beckman Coulter，美國); 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo,美國)；生物安全柜(ESCO，新加坡)；多功能酶標(biāo)儀(BioTek，美國)；-80℃超低溫冰箱(Thermo,美國)；倒置相差顯微鏡(Leica，德國)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

心肌H9c2細(xì)胞，用3%胎牛血清和100 U/ml青霉素+鏈霉素100 μg/ml的DMEM培養(yǎng)液，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 FE對H9c2細(xì)胞存活率的檢測

1×104個密度的心肌H9c2細(xì)胞接種96孔培養(yǎng)板中，每孔0.1 ml細(xì)胞混懸液，傳代3-4次，當(dāng)細(xì)胞生長約85%時，棄去培養(yǎng)基，分為對照組(control)：加入3% 胎牛血清的DMEM 0.1ml ；FE組：分別加入含0、250、500、1000、1250、1500 μg/ml FE的DMEM 0.1ml，作用48 h后,先于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，然后每孔加20 μl MTT， 37℃孵育4 h，棄上清，加DMSO溶解，采用酶標(biāo)儀(570 nm)記錄各孔的光密度(optical density, OD).取10孔OD值平均數(shù)，計算公式：細(xì)胞存活率(%)=處理組OD/對照組OD×100%，重復(fù)10次。

1.5 細(xì)胞肥大模型及給藥分組

心肌H9c2細(xì)胞胰酶消化后，加含3%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基種于 24 孔培養(yǎng)板，24 h 后分為對照組及 Iso 1、 2、5 和 10 μmol/L 濃度組。48 h 后 0.25%胰酶消化， Vicell 細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)后進(jìn)行二辛可酸(BCA)蛋白含量檢測。細(xì)胞分4組：對照組、2 μmol/L Iso 組、2 μmol/L Iso+FE 400 μg/L 組 、2 μmol/L Iso+FE 1000 μg/L 組。

1.6 心肌H9c2細(xì)胞直徑的測定

藥物作用 48 h 后，各組細(xì)胞用胰蛋白酶消化使之脫落，在相差顯微鏡下用測微器測定細(xì)胞直徑，觀察 6個視野，每個視野測 10個細(xì)胞，取其平均值( 每組取 10 次樣本進(jìn)行分析) 。

1.7 心肌細(xì)胞蛋白含量測定

藥物作用 48 h 后消化各組細(xì)胞，并在倒置顯微鏡下記錄細(xì)胞數(shù)。提取細(xì)胞總蛋白，按 BCA 蛋白含量檢測試劑盒說明書，檢測各組細(xì)胞中總蛋白含量。以總蛋白含量/細(xì)胞數(shù)為指標(biāo)評價藥物對Iso誘導(dǎo)CH的影響。

1.8 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度檢測

心肌H9c2 細(xì)胞給藥 48 h 后吸棄上清液，加入鈣-4 試劑。37 ℃培養(yǎng)箱中孵育 90 min。使用多功能讀板機(jī) Flexstation 3 檢測各孔的熒光值(檢測條件：激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為525 nm)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 FE對H9c2細(xì)胞存活率的影響

對照組、FE 250、500、1000、1250和1500 μg/ml劑量組的OD值分為0.41±0.01、0.40±0.04、0.41±0.05、0.40±0.03、0.31±0.04、0.15±0.03?？梢?，與對照組比較,FE在濃度1250 μg/ml及以上時, OD值明顯下降，顯示明顯的細(xì)胞毒性(P<0.05 或P<0.01)。FE的實驗用藥濃度以250-1 000 μg/ml較好，因此后續(xù)實驗設(shè)400和1000 μg/ml。

2.2 FE對H9c2細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

相差顯微鏡下，對照組心肌細(xì)胞呈三角形、梭形或不規(guī)則形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)向外伸出長短不同的突起，呈放射狀排列。Iso模型組細(xì)胞多飽滿呈三角形或圓形，且見細(xì)胞肥大，見少數(shù)凋亡及壞死細(xì)胞，心肌細(xì)胞直徑增加；而FE組的心肌細(xì)胞直徑均有不同程度減小(表1, 圖1)。

Tab. 1 Effect of FE on diameter and protein concentration of H9c2cardiomyocytes induced by n=10)

Fig. 1 Morphology of H9c2 cardiomyocytes in each group after crystal violet staining for 48 n=10, ×100)

2.3 FE對心肌H9c2細(xì)胞蛋白總量的影響

作用 48 h 后，測定對照組、1μmol/L、 2μmol/L、 5μmol/L、10μmol/L Iso組蛋白濃度分別為(61.25±9.52)g/L、 (89.74±9.12)g/L、(134.23±12.08)g/L、(120.15±1.46)g/L和(90.42±10.11)g/L，與對照組比較，Iso均能促進(jìn)心肌H9c2 細(xì)胞蛋白總量增加(P<0.01)，但以 2 μmol/L Iso 效果最佳。因此，選擇2 μmol/L Iso為后續(xù)實驗中的模型濃度(表1)，與對照組比較，Iso組心肌H9c2細(xì)胞內(nèi)蛋白總量顯著增加(P<0.01)；與Iso組比較，不同濃度FE組心肌H9c2細(xì)胞內(nèi)蛋白總量顯著減少(P<0.05或P<0.01, 表 1)。

2.4 FE對心肌 H9c2細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i的影響

與正常對照組相比較，Iso組心肌H9c2細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i顯著增加(P<0.01)。與Iso 組相比較，不同濃度FE組心肌 H9c2細(xì)胞內(nèi) [Ca2+]i顯著減少(P<0.05 或，P<0.01, 表1)。

3 討論

Iso為心肌細(xì)胞膜β受體激動劑，可加快心率,傳導(dǎo)，增加心肌耗氧量，增加環(huán)磷酸腺苷生成和糖原合成增加，促進(jìn)心肌細(xì)胞總蛋白合成，心肌收縮力增強(qiáng)，心肌膠原沉積，進(jìn)而誘發(fā)CH[3.4]。本實驗將 Iso作用于培養(yǎng)的心肌 H9c2細(xì)胞，48 h 后，細(xì)胞總蛋白含量顯著增加，結(jié)合細(xì)胞直徑明顯增加,表明已成功復(fù)制CH模型，。

浙八味名貴中藥材之一貝母,中醫(yī)臨床常用于潤肺止咳,療效顯著。對其提取物進(jìn)行研究，拓展其臨床適應(yīng)癥，具有重要的社會價值及臨床意義[2]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度FE均能顯著降低Iso 誘導(dǎo)的H9c2單個細(xì)胞直徑，抑制 H9c2細(xì)胞總蛋白含量升高，顯示了FE對 CH可能有保護(hù)作用。

Ca2+激活的信號通路被認(rèn)為在CH中發(fā)揮關(guān)鍵作用。心肌胞漿[Ca2+]i升高，進(jìn)一步激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶，使活化T細(xì)胞核因子去磷酸化并進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)CH相關(guān)基因活化.最終引起心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)增加，誘發(fā)CH[3，4]；同時，[Ca2+]i增加可導(dǎo)致心肌成纖維細(xì)胞蛋白合成增加，誘發(fā)成纖維細(xì)胞增殖，膠原沉積增多，心臟纖維化，CH。本研究結(jié)果顯示。Iso顯著升高[Ca2+]i，這與國外文獻(xiàn)報道一致[5]。給予不同濃度FE均能顯著抑制 Iso 誘導(dǎo)的[Ca2+]i升高。

綜上所述，本實驗研究,證明 了FE對Iso誘導(dǎo)H9c2 CH有保護(hù)作用，推測可能與降低細(xì)胞內(nèi)鈣，抑制鈣信號通路激活有關(guān)，為進(jìn)一步臨床研究FE抗CH作用提供了基礎(chǔ)資料。