王珊璽， 謝菊英， 謝 興， 李淑珍

(1. 湘南學(xué)院醫(yī)學(xué)影像檢驗(yàn)與康復(fù)學(xué)院， 湖南 郴州 423000； 2. 湘南學(xué)院附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科， 湖南 郴州 423000；3. 湘南學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科， 湖南 郴州 423000)

骨質(zhì)疏松癥是以骨量減少、骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化導(dǎo)致骨的脆性增高和骨折危險(xiǎn)性增加的一種系統(tǒng)性、全身性慢性代謝性骨疾病，全球范圍內(nèi)，近2億人受到骨質(zhì)疏松癥的影響，而且每年的患病率都在顯著增加[1]。目前，診斷為骨質(zhì)疏松癥的婦女的治療選擇包括骨質(zhì)疏松癥專用藥物，生活方式干預(yù)以及鈣(Ca)和維生素D攝入量的增加。但是，許多患有骨質(zhì)疏松癥引起骨折的患者常常無(wú)法正確診斷，導(dǎo)致無(wú)法獲得美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)可的有效療法[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，其在老年人中更為普遍，尤其是絕經(jīng)后婦女的發(fā)病率超過(guò)60%，卵巢激素缺乏癥是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松婦女的主要危險(xiǎn)因素[3-4]。雌激素是骨代謝的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子，雌激素缺乏被認(rèn)為是導(dǎo)致骨密度降低、機(jī)械負(fù)荷增加導(dǎo)致骨重塑和骨質(zhì)疏松發(fā)展的原因。由于雌激素的作用主要由雌激素受體(ER)介導(dǎo)，包括雌激素受體-α(ERα)和雌激素受體-β(ERβ)通過(guò)結(jié)合不同的配體來(lái)介導(dǎo)各種生物學(xué)效應(yīng)[5-7]。然而，目前關(guān)于ERα基因過(guò)表達(dá)對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松后骨代謝及鈣磷代謝的影響研究報(bào)道較少。因此，本研究通過(guò)構(gòu)建ERα基因過(guò)表達(dá)去卵巢骨質(zhì)疏松模型小鼠，探討ERα基因過(guò)表達(dá)對(duì)骨代謝及鈣磷代謝的影響，為雌激素替代治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松首選方案提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇SPF級(jí)12-14周雌性小鼠30只，體重為18-22 g，購(gòu)自武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

戊巴比妥鈉(上海生工生物工程公司)；青霉素(華北制藥股份有限公司)；Ca試劑盒、P試劑盒、骨鈣素ELISA試劑盒、堿性磷酸酶試劑盒(均購(gòu)自南京建成生物工程研究所)；DAB 試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；石蠟、蘇木素(均購(gòu)自Sigma)；中性樹膠(Wellbio)；兔抗鼠TIMP-1抗體、兔抗鼠MCP-1抗體(美國(guó)Abcom公司)；山羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 主要儀器

ZKKS-MCT型顯微鏡(micro-CT)系統(tǒng)(德國(guó)Siemens AG公司)；5KN0405型材料試驗(yàn)機(jī)(英國(guó)勞埃德儀器公司)；組織切片機(jī)(M199，德國(guó)萊卡公司)；離心機(jī)(日本Kubota公司)；顯微鏡(BA210T，Motic)；分光光度儀(德國(guó)Eppendorf公司)；雙能X骨密度儀(美國(guó)Hologic公司)。

1.4 建立動(dòng)物模型和分組

按隨機(jī)化原則將小鼠分為假手術(shù)組、模型組和ERα過(guò)表達(dá)組，各10只。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[8]建立去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠模型。假手術(shù)組不切除雙側(cè)卵巢，僅切除卵巢周圍脂肪。術(shù)后給予青霉素抗感染，并注意保溫。模型建立完成5 d后，ERα過(guò)表達(dá)組通過(guò)椎體髓腔注射的方法轉(zhuǎn)染攜帶小鼠ERα基因的重組腺病毒載體15 μl，模型組轉(zhuǎn)染空載病毒15 μl，假手術(shù)組不作處理。轉(zhuǎn)染7 d后進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)檢測(cè)。

1.5 骨密度檢測(cè)

造模結(jié)束后麻醉小鼠，置于雙能X線吸收測(cè)量?jī)x平臺(tái)上測(cè)定股骨骨密度(BMD)，根據(jù)BMD含量判斷是否造模成功并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)小鼠骨組織ERα基因表達(dá)水平

將股骨加入液氮，研磨至粉末后按體重體積比1∶9加入生理鹽水在冰浴中充分研磨，制成10%骨勻漿，然后8 000 r/min離心10 min取上清，加入1 ml Trizol裂解液提取骨組織勻漿總RNA，并計(jì)算RNA的純度和濃度；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并采用SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)ERα基因的表達(dá)水平。引物的設(shè)計(jì)與合成由上海生工公司完成。引物設(shè)計(jì)如下：ERα上游5'-AGGCGGCATACGGAAAGAC-3'，下游5'-CATTTCGGCCTTCCAAGTCA-3'；GAPDH上游5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次，根據(jù)公式2-△△Ct計(jì)算ERα基因表達(dá)水平。

1.7 Micro-CT掃描

取小鼠左側(cè)股骨，剔除肌肉組織，對(duì)股骨中心點(diǎn)及遠(yuǎn)心端進(jìn)行Micro-CT掃描測(cè)量骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)。

1.8 骨代謝及鈣磷代謝相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

腹主動(dòng)脈取血，靜置后3 500 r/min 離心5 min分離血清。按試劑盒說(shuō)明說(shuō)對(duì)小鼠骨鈣素(BGP)、堿性磷酸酶(ALP)、鈣(Ca)、磷(P)進(jìn)行檢測(cè)。

1.9 骨生物力學(xué)強(qiáng)度檢測(cè)

取小鼠右側(cè)股骨，剔除肌肉組織，放置于5KN0405材料試驗(yàn)機(jī)上進(jìn)行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)。加載點(diǎn)于股骨中點(diǎn)，跨距為18 mm，加載速度為2 mm/min，記錄并計(jì)算最大載荷和剛性系數(shù)。

1.10 免疫組化檢測(cè)骨組織中TIMP-1和MCP-1的蛋白表達(dá)水平

將10%中性福爾馬林溶液固定、石蠟包埋的標(biāo)本切成4 μm厚的切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇逐步水化后將切片置于枸櫞酸鈉緩沖液中煮沸15 min進(jìn)行抗原修復(fù)。3%雙氧水浸泡10 min，用于去除內(nèi)源性酶。每張切片的組織上滴加50 μl山羊血清，封閉30 min。棄去山羊血清，加50 μl兔抗鼠TIMP-1抗體和兔抗鼠MCP-1抗體孵育，4℃過(guò)夜。次日，棄去一抗后滴加二抗孵育30 min。滴加DAB顯色劑，鏡下觀察組織顏色。之后進(jìn)行蘇木素復(fù)染。依次經(jīng)過(guò)70%、80%、90%、95%、無(wú)水乙醇各5 min，二甲苯20 min后用中性樹脂封片。顯微鏡下觀察TIMP-1和MCP-1的蛋白表達(dá)，每個(gè)樣本隨機(jī)選擇6個(gè)視野，分析各個(gè)視野的平均光密度值(A值)。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠骨組織ERα基因表達(dá)水平的比較

與假手術(shù)組(1.00±0.09)相比，模型組小鼠骨組織ERα基因表達(dá)水平(0.43±0.08)顯著降低(P<0.05)；ERα過(guò)表達(dá)組小鼠骨組織ERα基因表達(dá)水平(3.06±0.15)顯著上升(P<0.05)。

2.2 ERα過(guò)表達(dá)對(duì)各組小鼠BMD及骨參數(shù)的影響

與假手術(shù)組相比，模型組和ERα過(guò)表達(dá)組小鼠BMD、BV/TV、Tb.Th顯著降低、Tb.Sp顯著升高(P<0.05)；ERα過(guò)表達(dá)組小鼠BMD、BV/TV、Tb.Th較模型組小鼠顯著上升、Tb.Sp顯著降低(P<0.05)。各組小鼠Tb.N比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05，表1)。

Tab. 1 Comparison of BMD and bone parameters of mice in each n=10)

2.3 ERα過(guò)表達(dá)對(duì)各組小鼠骨生物力學(xué)的影響

與假手術(shù)組相比，模型組和ERα過(guò)表達(dá)組最大載荷和剛性系數(shù)顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，ERα過(guò)表達(dá)組組最大載荷和剛性系數(shù)均顯著升高(P<0.05，表2)。

Tab. 2 Comparison of bone biomechanics of mice in each n=10)

2.4 ERα過(guò)表達(dá)對(duì)各組小鼠血清中骨代謝及鈣磷代謝指標(biāo)的影響

與假手術(shù)組相比，模型組BGP和ALP顯著升高，Ca和P顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，ERα過(guò)表達(dá)組BGP和ALP顯著降低，Ca和P顯著升高(P<0.05，表3)。

2.5 ERα過(guò)表達(dá)對(duì)各組小鼠骨組織中TIMP-1和MCP-1蛋白表達(dá)的影響

TIMP-1和MCP-1陽(yáng)性表達(dá)均表達(dá)于胞漿中。與假手術(shù)組相比，模型組小鼠骨組織中TIMP-1平均光密度值顯著降低，而MCP-1平均光密度值顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，ERα過(guò)表達(dá)組TIMP-1平均光密度值顯著升高而MCP-1顯著降低(P<0.05，表4，圖1)。

Tab. 3 Comparison of bone metabolism and calcium and phosphorus metabolism of mice in each n=10)

Tab. 4 Comparison of mean optical density of TIMP-1 and MCP-1 in bone tissues of mice in each group(A value,

Fig. 1 The expressions of TIMP-1 and MCP-1 protein in bone homogenate of mice in each group (Scale bar=100 μm)

3 討論

卵巢切除誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥是最常見(jiàn)的骨質(zhì)疏松癥類型。在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中，骨形成和骨吸收是不平衡的，這是由于絕經(jīng)后雌激素水平降低引起的[9]。ERα被認(rèn)為是骨骼中雌激素保護(hù)作用的主要調(diào)節(jié)因子。ERα在成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中表達(dá)，并在這些細(xì)胞中起重要作用[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，在激素水平正常的情況下，雌激素可通過(guò)ERα在骨代謝中發(fā)揮級(jí)聯(lián)反應(yīng)，參與維持骨代謝平衡，且骨組織中ERα的表達(dá)具有雌激素依賴性，雌激素水平降低后，其受體轉(zhuǎn)錄和翻譯水平同時(shí)受到抑制[11]。另有研究發(fā)現(xiàn)，抑制microRNA-148a可通過(guò)ERα調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)防止卵巢切除術(shù)引起的骨質(zhì)疏松[12]。本研究在進(jìn)行兩側(cè)卵巢切除術(shù)建立骨質(zhì)疏松模型后轉(zhuǎn)染攜帶小鼠ERα基因的重組腺病毒載體，結(jié)果表明ERα過(guò)表達(dá)組ERα基因表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組和模型組，提示成功建立小鼠ERα基因過(guò)表達(dá)模型。

骨質(zhì)疏松癥的特點(diǎn)是由于骨轉(zhuǎn)換率的增加，骨密度(BMD)和骨體積指數(shù)(BV/TV)過(guò)度降低。BMD是反映人體骨骼代謝狀況的一項(xiàng)重要指標(biāo)，是目前公認(rèn)的診斷骨質(zhì)疏松和療效評(píng)估的金標(biāo)準(zhǔn)[13]。骨生物力學(xué)主要是研究骨組織在外界作用下的力學(xué)性能和骨在受力后所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)，骨量的減少和骨質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的改變均能影響骨生物力學(xué)，并降低生物力學(xué)強(qiáng)度。骨組織骨量及內(nèi)在的生物力學(xué)性能等指標(biāo)是判定骨質(zhì)疏松骨性能的重要指標(biāo)。同時(shí)，在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展進(jìn)程中，反映骨吸收與骨形成平衡狀況的骨代謝生化指標(biāo)也隨之發(fā)生變化[14-15]。有研究發(fā)現(xiàn)，去除卵巢后，雌激素分泌減少，導(dǎo)致BMD下降，骨量增加受阻，骨吸收大于骨形成、骨生物力學(xué)發(fā)生改變，骨脆性增加，引發(fā)骨質(zhì)疏松甚至骨折[16-18]。血清Ca和P測(cè)定可間接反應(yīng)骨代謝情況，血Ca降低，甲狀旁腺激素分泌增加，導(dǎo)致大量骨鈣入血，引起骨質(zhì)疏松。有研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)糖代謝可有效促進(jìn)血Ca含量，改善BMD以緩解二型糖尿病大鼠骨質(zhì)疏松[19]。本研究結(jié)果表明模型組小鼠BMD、Tb.Th、BV/TV、最大載荷、剛性系數(shù)、Ca和P等指標(biāo)均顯著降低，而Tb.Sp、BGP和ALP等指標(biāo)均升高，提示雌性小鼠去除雙側(cè)卵巢后發(fā)生骨質(zhì)疏松；ERα基因過(guò)表達(dá)后，BMD、Tb.Th、BV/TV、最大載荷、剛性系數(shù)、Ca和P等指標(biāo)均顯著升高，而Tb.Sp、BGP和ALP等指標(biāo)均顯著降低，提示ERα基因過(guò)表達(dá)后模型小鼠的各項(xiàng)指標(biāo)均有所改善；ERα對(duì)于改善去卵巢引起的骨質(zhì)疏松癥具有良好的效果。

TIMP-1是由骨細(xì)胞分泌的一類蛋白酶抑制劑，主要調(diào)控骨基質(zhì)代謝的平衡[20]。MCP-1是趨化因子家族中最具代表性的成員，作為炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的起始因子，可趨化單核細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，也可誘導(dǎo)陽(yáng)性端粒酶，使單核細(xì)胞在巨噬細(xì)胞集落刺激因子的刺激下產(chǎn)生破骨細(xì)胞，從而參與骨質(zhì)疏松癥的形成[21-22]。有研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)ERα可通過(guò)增加實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠腦組織中TIMP-1及TIMP-2抑制炎癥反應(yīng)[23]。另有研究發(fā)現(xiàn)，雌激素E2和ERα對(duì)脂多糖刺激的脂肪細(xì)胞MCP-1有抑制作用，可能與p38 MAPK/NF-κB級(jí)聯(lián)的抑制有關(guān)[24]。本研究結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，模型組小鼠骨組織中TIMP-1平均光密度值顯著降低而MCP-1平均光密度值顯著升高，ERα基因過(guò)表達(dá)后，TIMP-1平均光密度值顯著升高而MCP-1平均光密度值顯著降低，提示ERα基因過(guò)表達(dá)后可增加骨組織中TIMP-1的表達(dá)水平，同時(shí)降低MCP-1的表達(dá)水平，起到改善骨質(zhì)疏松癥的作用。

綜上所述，ERα基因過(guò)表達(dá)對(duì)骨質(zhì)疏松癥具有重要作用，其可能是通過(guò)調(diào)節(jié)骨密度及骨體積指數(shù)，改善骨代謝和鈣磷代謝，促進(jìn)骨組織TIMP-1的表達(dá)并降低MCP-1的表達(dá)，從而改善骨質(zhì)疏松。