趙 楊， 張玉雙， 王玉祥， 張 明， 史會(huì)娟， 李 晶△

(1. 河北醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院， 2. 河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院中醫(yī)科， 3. 河北省人民醫(yī)院， 石家莊 050017)

放射性直腸炎( radiation proctitis, RP)是盆腔惡性腫瘤患者放射線治療后的主要并發(fā)癥，其發(fā)病率在逐年增加，可高達(dá)20%。急性放射性直腸炎(acute radiation proctitis, ARP)的臨床表現(xiàn)包括腹痛、腹瀉、黏液便、里急后重等癥狀，嚴(yán)重可出現(xiàn)血便和腸梗阻，影響患者的生活質(zhì)量。目前西醫(yī)常見的治療有硫糖鋁、美沙拉嗪、皮質(zhì)類固醇、高壓氧艙等，雖有一定療效但不良反應(yīng)較多，且復(fù)發(fā)率高。中醫(yī)認(rèn)為此病多屬“腸癖”、“痢疾”、“腹痛”、“泄瀉”等范疇，放射線被認(rèn)為外來“火、熱、毒”邪，病機(jī)總屬熱毒內(nèi)侵，火熱毒邪損傷腸絡(luò)，故治療上以清熱涼血散瘀為基本原則[1]?；被ㄉ⒑习最^翁湯是治療痢疾的經(jīng)典方劑，針對(duì)臨床患者能夠有效緩解患者癥狀。本研究觀察了槐花散合白頭翁湯對(duì)ARP大鼠的的療效以及對(duì)NF-κB、ICAM-1、VCAM-1的影響，為ARP的中醫(yī)學(xué)防治提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)SD雌性大鼠40只，體質(zhì)量為160～180 g，由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度20℃～28℃，相對(duì)濕度在50%～60%之間，12 h明/暗循環(huán)環(huán)境下，飼喂標(biāo)準(zhǔn)水和動(dòng)物飼料，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及制備

槐花散合白頭翁湯：白頭翁10 g槐花散12 g 荊芥穗10 g 側(cè)柏葉10 g 枳殼10 g 秦皮10 g 黃連5 g 黃芩5 g(以上中藥均為顆粒劑，1副中藥顆粒劑為8.6 g，相當(dāng)于1副中藥72 g藥量，輔料主要成分是乳糖、淀粉等)，美沙拉嗪腸溶片，以上藥物均購(gòu)自神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，粉碎后合成散劑放置于4℃冰箱密封保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及主要試劑

Elekta Synergy醫(yī)用直線加速器(醫(yī)科達(dá)醫(yī)療器械有限公司 中國(guó)上海)；D3024R臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī)(美國(guó)Scilogex公司)；Nanopure超純水儀(Thermo Fisher Scientific公司)電泳儀(Bio-Red公司 美國(guó)加利福尼亞州)；EVOS FL Auto 2全自動(dòng)活細(xì)胞成像系統(tǒng)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；水合氯醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 中國(guó)上海)；核因子-κB(NF-κB)的抗體、ICAM-1、VCAM-1 ELISA試劑盒均來自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方法

將40只SD大鼠隨機(jī)分為4組，Control組、Model組、Mesalazine組(陽性對(duì)照組)和Formular組，每組10只。除Control組外，其余各組大鼠造模成功后開始灌胃治療，1 次/d，連續(xù) 14 d。按成人臨床等效劑量(體表面積法折算)[2]， Control組、Model組均給予生理鹽水灌胃每天10 ml/kg，Mesalazine組和Formular組藥物分別用去離子水稀釋為美沙拉嗪溶液和中藥湯劑，Mesalazine組給予美沙拉嗪溶液 0.27 g/kg 灌胃，F(xiàn)ormular組分別給予(0.91 g/kg) 灌胃，四組大鼠灌胃所有大鼠灌胃體積為每天10 ml/kg，連續(xù)14 d。

1.5 造模

除Control組不予照射外，其余各組大鼠均接受6MV-X線照射。各照射組大鼠于照射前8 h禁食，各組大鼠使用水合氯醛進(jìn)行麻醉，待大鼠肌肉完全松弛后，以仰臥體位將其固定在特制照射板上，以 6MV-X線直線加速器單次大劑量照射，照射范圍自恥骨聯(lián)合至肛門，照射野面積3 cm×4 cm，源皮距80 cm, 照射劑量為20 Gy[3]。 照射完畢后，送返實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繼續(xù)飼養(yǎng)。觀察大鼠情況，照射后出現(xiàn)腹瀉、黏液膿血便癥狀和直腸病理改變則造模成功。

1.6 一般情況觀察

照射后連續(xù)觀察14 d，每天稱取大鼠重量，比較四組大鼠一般征象評(píng)分，包括飲食攝水量、排便情況、體重、活動(dòng)度、反應(yīng)速度、毛發(fā)光澤、有無消瘦、便血、死亡等情況。

1.7 判定標(biāo)準(zhǔn)

自擬大鼠一般征象評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：1分，大便成形，肛周皮毛無損，飲食、飲水無明顯變化，體質(zhì)量無減輕，活動(dòng)自如，皮毛光潔；2分，大便不成形，黏液便，肛周皮膚脫毛潮紅，直徑<0.5 cm，飲食、飲水稍減少，體質(zhì)量減輕1～2 g，喜靜，皮毛光潔度差；3分，腹瀉、黏液、血便、肛周皮膚脫毛潮紅，直徑0.5～1 cm，飲食、飲水明顯減少，體質(zhì)量減輕2～3 g，蜷縮少動(dòng)現(xiàn)象，皮毛欠光潔；4分，腹瀉、水樣便和/或肛門出血，肛周皮膚脫毛潮紅，直徑>1.0 cm，拒食、拒水，體質(zhì)量減輕>3 g，蜷縮少動(dòng)，有弓背扭體現(xiàn)象，皮毛不光潔。

1.8 直腸病理組織學(xué)觀察

取2 cm直腸組織，10%多聚甲醛固定后，清洗、包埋、切片后HE染色，顯微鏡下觀察直腸組織病理形態(tài)變化。

1.9 生化指標(biāo)檢測(cè)

取凍存直腸組織，研磨勻漿，放入低溫離心機(jī)離心，取上清液，BCA蛋白定量后，采用Western blot法檢測(cè)直腸組織中NF-κB蛋白表達(dá)，采用ELISA法檢測(cè)血清中ICAM-1、VCAM-1含量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般情況

各照射組經(jīng)照射后，前2日無明顯變化，于第三天開始出現(xiàn)不同程度攝食量、飲水量的減少，反應(yīng)遲緩、毛色不潔、蜷縮少動(dòng)，有不同程度的稀便、黏液便出現(xiàn)，大便次數(shù)增多。第5日開始個(gè)別嚴(yán)重者出現(xiàn)柏油樣便和膿血便現(xiàn)象。與Contol組比較，Model組評(píng)分顯著升高(P<0.01)，Mesalazine組和Formula組評(píng)分高于Contol組。Mesalazine組和Formula組一般征象評(píng)分低于Model組(P<0.01)，F(xiàn)ormula組評(píng)分低于Mesalazine組(P>0.05，表1)。

Tab. 1 The general signs of each group were scored at different n=10)

2.2 槐花散合白頭翁湯對(duì)大鼠體重的影響

記錄各組大鼠自給藥第1日開始到給藥后第14日每天平均體重變化。給藥后1～4 d各組大鼠體重?zé)o明顯差異；第5日開始用藥組體重增長(zhǎng)變快，Control組日平均體重高于其他各組，Model組日平均體重最低(P<0.05)；照射后第7日，Mesalazine組和Formula組體重稍有增加，Model組與Control組比較體重下降明顯(P<0.01) ，其余各組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05) ；至第14日，Model組明顯低于Control組(P<0.01)，F(xiàn)ormula組與Mesalazine組體重均高于Model組(P<0.01)，與Control組比較體重相差較小。Formula組與Mesalazine組比較，體重相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

Tab. 2 The average daily weight of rats in each group(g, n=10)

2.3 槐花散合白頭翁湯對(duì)大鼠直腸組織病理形態(tài)學(xué)的影響

光學(xué)顯微鏡下觀察可見，Control組直腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)較好，直腸隱窩無擴(kuò)張、畸形，直腸組織黏膜無潰爛、出血和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與Control組比較，Model組上皮細(xì)胞稀疏，部分脫落、糜爛、壞死，絨毛高度降低，黏膜及黏膜下出現(xiàn)明顯的空泡樣變性，間質(zhì)纖維增多，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，結(jié)合上述大鼠ARP癥狀則表明造模成功；Mesalazine組與Model組比較，直腸上皮細(xì)胞完整性較好，腺體結(jié)構(gòu)改變較輕；Formular組與Model組比較，病變明顯減輕，直腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)較好，無明顯潰爛、出血和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1)。

Fig. 1 Pathological changes of rats in each group(Original magnification × 200)

2.4 槐花散合白頭翁湯對(duì)大鼠血清中ICAM-1、VCAM-1含量的影響

與Control組比較，Model組大鼠血清中ICAM-1、VCAM-1含量顯著增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P< 0.01)，Mesalazine組和Formula組ICAM-1、VCAM-1含量增加較少。與Model組比較Mesalazine組和Formula組大鼠血清中ICAM-1、VCAM-1水平顯著低于Model組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)與Mesalazine組比較Formula組大鼠血清中ICAM-1、VCAM-1水平略低于Mesalazine組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表3)。

Tab. 3 Effects of huaihua powder and baitouweng formula decoction on the contents of ICAM-1 and VCAM-1 in serum of rats(ng/ml， n=10)

2.5 槐花散合白頭翁湯對(duì)結(jié)腸病理組織中NF-κB蛋白表達(dá)的影響

與Control組比較，Model組NF-κB蛋白表達(dá)顯著增多(P<0.01)，Mesalazine組和Fomular組NF-κB蛋白表達(dá)相近(P>0.05)。與Model組比較，Mesalazine組和Fomular組NF-κB蛋白表達(dá)均低于Model組(P<0.05)。與Mesalazine組比較，F(xiàn)ormula組NF-κB蛋白表達(dá)略低于Mesalazine組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖2，表3)。

Fig. 2 Effect of paitouweng decoction on the expression of NF-κB protein in the rectum of ARP rats

3 討論

目前針對(duì)急性放射性直腸炎(acute radiation enteritis，ARP)的發(fā)展及作用機(jī)制，尚未完全明確，臨床治療方法比較單一，治療效果一般，且存在較高復(fù)發(fā)率。美莎拉嗪為臨床上常見的治療ARP的藥物。中醫(yī)認(rèn)為此病多屬“腸癖”、“痢疾”、“腹痛”、“泄瀉”等范疇，放射線是放射性直腸炎的特殊因素，中醫(yī)認(rèn)為其為外來“火、熱、毒”邪[1]。放射性直腸炎病機(jī)總屬正氣虧虛、熱毒內(nèi)侵，故脾氣虛弱，水濕不化，濕熱下迫大腸，導(dǎo)致大便次數(shù)增多，火熱毒邪損傷腸絡(luò)，導(dǎo)致便下黏液膿血甚至便血，故治療上以清熱涼血散瘀為基本原則。我們前期臨床研究表明，槐花散合白頭翁湯治療ARP患者，能夠有效縮短癥狀緩解時(shí)間，減輕患者臨床癥狀，尤其在大便次數(shù)、腹痛、里急后重、黏液便、便血等方面效果明顯[4]。

槐花散中槐花苦微寒，善清大腸濕熱，涼血止血，為君藥。側(cè)柏葉清熱止血，可增強(qiáng)君藥涼血止血之力，為臣藥。荊芥穗炒用入血分而止血，枳殼行氣寬腸，，共為佐藥，以達(dá)“氣調(diào)則血調(diào)”之目的。白頭翁湯中以白頭翁為君，清熱解毒，涼血止痢。臣以黃連之苦寒，清熱解毒；黃芩清熱燥濕，共奏燥濕止痢之效。秦皮苦寒性澀，收斂作用強(qiáng)，四藥并用，為熱毒血痢之良方?；被ㄉ⒑习最^翁湯諸藥合用，行氣與止血相得益彰，踐行了“行血?jiǎng)t便膿自愈，調(diào)氣則后重自除”的治療方法?，F(xiàn)代研究表明槐花可治療痔瘡和腸道出血，具有抗炎、抗出血、抗氧化、抗腫瘤的作用[5]，白頭翁主要成分Anemoside B4具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)的特性[6]，側(cè)柏葉具有抗菌、抗腫瘤、凝血、抗炎的功效[7]，黃連具有抗炎抗氧化保護(hù)腸粘膜的作用[8-9]。

ARP的常見癥狀為大便次數(shù)增多、腹痛、腹瀉、里急后重、黏液膿血便等。早期研究表明，腸損傷在放療開始后的幾天內(nèi)就變得明顯，并且主要是由于迅速擴(kuò)散的隱窩上皮細(xì)胞死亡和固有層長(zhǎng)時(shí)間的急性炎癥反應(yīng)所致，隱窩細(xì)胞死亡會(huì)導(dǎo)致絨毛上皮的置換不足，黏膜屏障破壞和黏膜炎癥[10]。本次實(shí)驗(yàn)顯示，與Model組相比Formular組能夠明顯減輕ARP大鼠大便次數(shù)、腹瀉、黏液膿血便、體重等癥狀(P<0.01)，與Mesalazine組比較Formular組腹瀉次數(shù)，腹瀉，便血情況較好。病理結(jié)果顯示Formular組較Model組直腸黏膜形態(tài)、上皮細(xì)胞完整性和腺體結(jié)構(gòu)改變較輕(P<0.05)。以上提示，槐花散合白頭翁湯通過改善ARP大鼠直腸組織黏膜損害進(jìn)而改善ARP大鼠腹瀉、黏液膿血便等癥狀。

輻射可導(dǎo)致多種微血管病理學(xué)改變，微血管損傷在放射性直腸炎中扮演著極其重要的角色[11]。血管細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)和細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)屬于免疫球蛋白超家族成員，分布在內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞等表面，是血管炎癥期間由內(nèi)皮分泌的關(guān)鍵分子[12]。通常在正常情況下，ICAM-1和VCAM-1不表達(dá)或很少表達(dá)，當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí)，在炎癥因子白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等刺激下表達(dá)迅速上升，增強(qiáng)了單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附，促進(jìn)炎癥的發(fā)生和發(fā)展[13-14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Formular組血清中ICAM-1、VCAM-1的含量顯著低于Model組(P<0.01)，以上提示槐花散合白頭翁湯能夠降低大鼠血清中ICAM-1、VCAM-1的含量，從而改善微血管循環(huán)障礙，降低微血管損傷，進(jìn)而抑制炎癥的發(fā)展。

在ARP發(fā)病過程中，NF-κB通路的激活是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，其中p65蛋白是NF-κB通路啟動(dòng)的關(guān)鍵蛋白，當(dāng)炎癥發(fā)生并啟動(dòng)NF-κB通路時(shí)，p65蛋白與NF-κB因子分離，在組織中的表達(dá)增多，其激活后可促進(jìn)促炎細(xì)胞因子、趨化因子及黏附分子等的釋放[15-16]。在急性期，由于緊密連接的表達(dá)減少和上皮細(xì)胞死亡引起的粘膜破壞導(dǎo)致炎癥[17]。受損的血管內(nèi)皮刺激細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子的分泌以及粘附分子的表達(dá)[18]。大劑量放射線照射后，直腸發(fā)生炎癥反應(yīng)，激活NF-κB信號(hào)通路[19-20]。ICAM-1、VCAM-1基因的啟動(dòng)子區(qū)域具有NF-κB的作用結(jié)合位點(diǎn)，活化的NF-κB可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1的基因表達(dá)，進(jìn)而參與炎癥反應(yīng)[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Model組直腸組織中NF-κB蛋白表達(dá)明顯高于Formular組(P<0.01)，Mesalazine組和Formular組NF-κB蛋白表達(dá)低于Model組，以上結(jié)果表明，槐花散合白頭翁湯能夠下調(diào)ARP大鼠直腸組織NF-κB蛋白表達(dá)，降低大鼠血清中ICAM-1、VCAM-1的含量，改善直腸粘膜和微血管循損傷，從而減輕病變，美莎拉嗪為臨床上常見的治療ARP的藥物，且具有一定治療效果，本研究中美莎拉嗪與槐花散合白頭翁湯治療效果相近，甚至后者在改善直腸炎癥狀方面效果更好。

綜上所述，本研究通過直線加速器照射建立ARP模型，探討了槐花散合白頭翁湯在改善ARP大鼠癥狀、調(diào)節(jié)ARP大鼠NF-κB、ICAM-1、VCAM-1方面的作用。研究結(jié)果可見，槐花散合白頭翁湯能夠改善放射線對(duì)腸道粘膜造成的病理損傷，通過降低NF-κB、ICAM-1、VCAM-1，來抑制炎癥反應(yīng)，減輕放射線導(dǎo)致的微血管和腸道黏膜病變，其具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。