王 恬， 張福林， 趙 越， 郭東棟， 楊 瑞

(延安市人民醫(yī)院腫瘤血液科， 陜西 延安 716000)

血管瘤(hemangiomas，HAs)是最常見的嬰兒腫瘤，是由內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖和血管生成引起的良性血管腫瘤。大多數(shù)血管瘤是自限性的，病灶沒有潛在的并發(fā)癥或侵襲性，其在生命的第一年中處于快速生長階段，然后緩慢退化。但大約10%的血管瘤會(huì)表現(xiàn)出快速生長，并具有破壞性、毀容性甚至威脅視力或生命[1]。因此，有必要研究嬰兒血管瘤發(fā)病的相關(guān)機(jī)制，并制定合理的治療策略。小RNA(microRNA，miR)是小的非編碼RNA，通過作用于mRNA的3'-非翻譯區(qū)來轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)mRNA基因的表達(dá)，在許多生物學(xué)過程(例如細(xì)胞增殖和凋亡，腫瘤血管生成等)中具有重要作用[2]。miRNA在腫瘤抑制和癌基因調(diào)控中都起著重要作用，并且表現(xiàn)出復(fù)雜的組織和疾病特異性表達(dá)模式，具有調(diào)控許多對(duì)致癌過程至關(guān)重要的靶標(biāo)作用[3]。先前的研究證實(shí)，許多miRNA參與了嬰兒血管瘤的發(fā)展，例如，microRNA-143通過靶向Bcl-2抑制嬰兒血管瘤的生長[4]。已有研究表明miR-125b-5p在血管瘤細(xì)胞中下調(diào)[5]。此外，髓樣細(xì)胞白血病-1 (myeloid cell leukemia-1, Mcl-1)蛋白參與了多種細(xì)胞系的凋亡、分化和細(xì)胞周期的調(diào)控，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長至關(guān)重要，抑制Mcl-1蛋白有望成為臨床治療腫瘤的新策略[6]。因此，本文主要研究miR-125b-5p 對(duì)人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞HemECs增殖、凋亡的影響及其機(jī)制，以期為血管瘤的靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基(上?；鄯f生物科技有限公司，貨號(hào)：C22400500BT)，胎牛血清、青霉素和鏈霉素雙抗溶液(上海素爾生物科技有限公司，貨號(hào)：16000-044、15140122)，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(上海恪敏生物科技有限公司，貨號(hào)：11668-027)，miR-NC、miR-125b-5p mimic、miR-125b-5p inhibitor 、pc-MCL-1質(zhì)粒及各種引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成，SYBR-Green PCR試劑盒購自賽默飛世爾科技公司(貨號(hào)：4309155)，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司(貨號(hào)：GK8030-20)，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自北京原平皓生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)：GN201-01)，MTT試劑盒購自上海信裕生物工程有限公司(貨號(hào)：111105-500)；RIPA裂解緩沖液購自南京海克爾生物科技有限公司(貨號(hào)：SBJ-0999)，BCA試劑盒購自上海易色醫(yī)療科技有限公司(貨號(hào)：BC201)，cleaved caspase-3抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體、β- actin抗體購自碧云天生物科技有限公司(貨號(hào)：AC030-1、AB026、AB112、AF0003)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗、p70s6k抗體、p-p70s6k抗體購自上海艾博抗生物科技有限公司(貨號(hào)： ab6728，ab32529、ab47379)，p-AKT抗體、AKT抗體、p-mTOR抗體、mTOR抗體購自萬類生物科技有限公司(貨號(hào)：WLP001a、WLP003b、WL02476、WL02477)。

1.2 組織樣品

我院招募了20名嬰兒血管瘤患者，進(jìn)行切除血管瘤手術(shù)，收集手術(shù)中腫瘤組織(d = 2 mm)和與腫瘤相鄰的正常組織(d = 2 mm)。所有志愿者監(jiān)護(hù)人均簽署了有關(guān)臨床數(shù)據(jù)的書面知情同意書。該研究得到我院研究倫理委員會(huì)和臨床醫(yī)學(xué)學(xué)院的批準(zhǔn)，并根據(jù)《赫爾辛基宣言》的道德準(zhǔn)則進(jìn)行。

1.3 細(xì)胞及培養(yǎng)

人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞HDEC和鼠血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞CRL-2586 EOMA購自上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞HemECs和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。細(xì)胞于含體積分?jǐn)?shù)為10% 胎牛血清、100 U/ml的青霉素和100 μg/ml的鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃，體積分?jǐn)?shù)為5% CO2下培養(yǎng)。

1.4 RT-qPCR檢測miR-125b-5p與MCL-1 mRNA的表達(dá)

將所有組織樣品剪碎并研磨，采用QIAzol裂解試劑提取總RNA，采用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)，將各細(xì)胞分別接種在6孔板中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到近90% 融合時(shí)，采用QIAzol裂解試劑提取總RNA，采用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。RT-qPCR采用SYBR-Green PCR試劑盒說明書操作進(jìn)行。miR-125b-5p的上游引物序列：5′-GGCAACCTTGCGACTATAACCA-3′，miR-125b-5p的下游引物序列：5′-GTTTCCTCTCCCTGAGACCCTA-3′；MCL-1 的上游引物序列：5′-TATTTCTTTCGGTGCCTTTGT-3′；MCL-1 的下游引物序列：5′-AGTCCCGTTTCGTCCTTACA-3′；U6的上游引物序列：5′-GTGGTCCGCGTAGCGAGT-3′，U6的下游引物序列：5′-CGCTTCGGCAGCACAT-3′。

1.5 轉(zhuǎn)染HemECs細(xì)胞

取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，接種于6孔板(1×106cells/well)。當(dāng)達(dá)到80% 融合，采用無血清培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行饑餓培養(yǎng)，2 h后，采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，將100 nmol/L 的miR-NC、miR-125b-5p mimic、miR-125b-5p inhibitor 、pc-MCL-1質(zhì)粒分別或聯(lián)合轉(zhuǎn)染進(jìn)入HemECs細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，分別標(biāo)記為陰性對(duì)照組(miR-NC組)、過表達(dá)組(miR-125b-5p組)、抑制表達(dá)組(miR-125b-5p inhibitor組)以及空白對(duì)照組(Control組)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 MTT法檢測HemECs細(xì)胞增殖

將用轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在96孔板中孵育，分別在24 h、48 h、72 h、96 h時(shí)用10 μl MTT染料處理細(xì)胞，然后與100 μl二甲基亞砜孵育15 min。 用酶免疫分析儀在570 nm處測量吸光值。每組設(shè)9復(fù)孔。

1.7 蛋白印跡法檢測HemECs細(xì)胞增殖、凋亡、AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平

收集各組HemECs細(xì)胞，用RIPA裂解液提取總蛋白，并用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，然后經(jīng) SDS-PAGE分離蛋白后，用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF膜，并用脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，再加入兔來源的單克隆一抗(Ki67 1∶1 000、PCNA 1∶ 1 000、cleaved caspase-3 1∶1 000、Bax 1∶500、Bcl-2 1∶1 000、β- actin 1∶1 000、p-p70s6k 1∶1 000、 p70s6k 1∶1 000、p-AKT 1∶1 000、AKT 1∶1 000、p-mTOR 1∶500、 mTOR 1∶500)在4℃ 封閉過夜，接著加入對(duì)應(yīng)山羊抗兔二抗(1∶2 000)室溫封閉1 h，最后滴ECL曝光，以β- actin為內(nèi)參，使用Quantity One軟件進(jìn)行分析目標(biāo)蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)水平。每組設(shè)9復(fù)孔。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測HemECs細(xì)胞凋亡

培養(yǎng)48 h后，胰酶消化轉(zhuǎn)染HemECs細(xì)胞，離心， 按1×106cells/ml的濃度重懸。細(xì)胞懸液中加入5 μl Annexin-V- FITC和5 μl PI，在黑暗的房間里孵化15 min，然后用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞凋亡率(%)=早期細(xì)胞凋亡率+晚期細(xì)胞凋亡率。每組設(shè)9復(fù)孔。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告檢測靶向關(guān)系

收集生長至對(duì)數(shù)期的HemECs細(xì)胞接種在24孔板中，并孵育24 h。將1 μg螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因構(gòu)建體PGL3-MCL-1-WT(MCL-1野生型)或PGL3-MCL-1-MUT(MCL-1突變型)以及miR-125b-5p mimic或miR-NC和PRL-CMV海藻熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，HemECs細(xì)胞裂解15 min，雙熒光素酶檢測系統(tǒng)測量熒光素酶的相對(duì)活性，用螢火蟲熒光素酶活性和腎熒光素酶活性比值表示熒光素酶的相對(duì)活性。每組設(shè)9復(fù)孔。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 miR-125b-5p在血管瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)水平

通過RT-qPCR評(píng)估m(xù)iR-125b-5p表達(dá)的結(jié)果表明： miR-125b-5p在嬰兒血管瘤組織表達(dá)水平明顯低于鄰近的正常組織(P<0.01)；miR-125b-5p在人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞HDEC、HemECs和鼠血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞CRL-2586 EOMA表達(dá)水平明顯低于在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC中的表達(dá)(P<0.01，表1)；因此選擇下調(diào)效果比較明顯的HemECs細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Tab. 1 The expression levels of miR-125b-5p in hemangioma tissues and n=9)

2.2 miR-125b-5p過表達(dá)對(duì)人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞HemECs增殖的影響

RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染后miR-125b-5p表達(dá)結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，miR-NC組細(xì)胞中miR-125b-5p表達(dá)無明顯變化，miR-125b-5p mimic組細(xì)胞中miR-125b-5p表達(dá)明顯上調(diào)，miR-125b-5p inhibitor組細(xì)胞中miR-125b-5p表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01，表2)，表明轉(zhuǎn)染成功。MTT法和蛋白印跡法檢測細(xì)胞增殖的結(jié)果顯示：隨著時(shí)間的增加，各組細(xì)胞吸光值逐漸出現(xiàn)差異；在96 h時(shí)，與Control組相比，miR-NC組細(xì)胞增殖及Ki67和PCNA表達(dá)無明顯變化，miR-125b-5p mimic組細(xì)胞增殖及Ki67和PCNA表達(dá)明顯減少，miR-125b-5p inhibitor組細(xì)胞增殖及Ki67和PCNA表達(dá)明顯增加(P<0.01，圖1，表2)。

Fig. 1 Effects of miR-125b-5p overexpression on the proliferation of human hemangioendothelial cells HemECs

Tab. 2 The expression levels of proliferation-related n=9)

2.3 miR-125b-5p過表達(dá)對(duì)人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞HemECs凋亡的影響

流式和蛋白印跡法檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示：與Control組相比，miR-NC組細(xì)胞凋亡率及cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2表達(dá)無明顯變化，miR-125b-5p mimic組細(xì)胞凋亡率及cleaved Caspase-3、Bax表達(dá)明顯升高、Bcl-2表達(dá)明顯降低(P<0.01)，miR-125b-5p inhibitor組細(xì)胞凋亡率及cleaved Caspase-3、Bax表達(dá)明顯降低、Bcl-2表達(dá)升高(P<0.05，P<0.01，圖2，表3)。

Fig. 2 Effects of miR-125b-5p overexpression on apoptosis of human hemangioendothelial cells HemECs

Tab. 3 Apoptosis rate and expressions of apoptosis-related n=9)

2.4 miR-125b-5p與MCL-1的靶向關(guān)系

通過TargetScan數(shù)據(jù)庫的預(yù)測，miR-125b-5p與MCL-1 3’UTR區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)(圖3A)。并通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證靶向關(guān)系，結(jié)果表明：miR-125b-5p高表達(dá)明顯抑制了含有野生型MCL-1質(zhì)粒的熒光素酶活性(P<0.01，表4)，但對(duì)突變型MCL-1質(zhì)粒的熒光素酶活性無影響。RT-qPCR評(píng)估MCL-1表達(dá)的結(jié)果表明：與鄰近的正常組織相比， MCL-1在嬰兒血管瘤組織中表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.01)；在嬰兒血管瘤組織中miR-125b-5p與MCL-1表達(dá)負(fù)相關(guān)(圖3B)；MCL-1在人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞HDEC、HemECs和鼠血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞CRL-2586 EOMA中表達(dá)水平均明顯高于在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC中的表達(dá)(P<0.01，表5)。通過蛋白印跡法檢測MCL-1表達(dá)結(jié)果(圖3C)所示：與對(duì)照組相比，miR-125b-5p mimic組細(xì)胞中MCL-1蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.01)，pc-MCL-1組細(xì)胞中MCL-1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)；與miR-125b-5p mimic組相比，miR-125b-5p+ pc-MCL-1組細(xì)胞中MCL-1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01，表6)；表明轉(zhuǎn)染成功。

Tab. 4 The effect of miR-125b-5p on luciferase n=9)

Tab. 5 The expression levels of MCL-1 in hemangioma tissues and n=9)

Tab. 6 Expressions of MCL-1 in each group after n=9)

2.5 過表達(dá)MCL-1對(duì)miR-125b-5p對(duì)HemECs細(xì)胞增殖和凋亡作用的影響

MTT法和蛋白印跡法檢測細(xì)胞增殖結(jié)果(圖4AB和表7)表明：隨著時(shí)間的增加，各組細(xì)胞吸光值逐漸出現(xiàn)差異；在96 h時(shí)，與對(duì)照組相比， miR-125b-5p mimic組細(xì)胞增殖及Ki67和PCNA表達(dá)明顯減少(P<0.01)，pc-MCL-1組細(xì)胞增殖及Ki67和PCNA表達(dá)明顯增加(P<0.01)；與miR-125b-5p mimic組相比，miR-125b-5p+ pc-MCL-1組細(xì)胞增殖及Ki67和PCNA表達(dá)明顯增加(P<0.01)。通過流式和蛋白印跡法檢測細(xì)胞凋亡情況結(jié)果(圖4CD和表7)顯示：與對(duì)照組相比， miR-125b-5p mimic組細(xì)胞凋亡率及cleaved Caspase-3、Bax表達(dá)明顯升高、Bcl-2表達(dá)明顯降低(P<0.01)，pc-MCL-1組細(xì)胞凋亡率及cleaved Caspase-3、Bax表達(dá)明顯降低、Bcl-2表達(dá)明顯升高(P<0.05，P<0.01)；與miR-125b-5p mimic組相比，miR-125b-5p+ pc-MCL-1組細(xì)胞凋亡率及cleaved Caspase-3、Bax表達(dá)明顯降低、Bcl-2表達(dá)明顯升高(P<0.01)。

Fig. 4 Effects of overexpressing MCL-1 on the proliferation and apoptosis of HemECs cells treatred with miR-125b-5p

Tab. 7 Apoptosis rate and expressions of proliferation , apoptosis-related proteins n=9)

2.6 miR-125b-5p靶向MCL-1對(duì)HemECs細(xì)胞AKT/mTOR通路的影響

蛋白印跡法檢測AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平結(jié)果(圖5，表8)顯示：與Control組相比， miR-125b-5p mimic組p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)，pc-MCL-1組p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；與miR-125b-5p mimic組相比，miR-125b-5p+ pc-MCL-1組p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)。

Fig. 5 Effects of miR-125b-5p targeting MCL-1 on AKT / mTOR pathway in HemECs cells

Tab. 8 Expression levels of AKT / mTOR pathway-related proteins n=9)

3 討論

血管瘤是最常見的嬰兒良性腫瘤，是由中胚層血管組織過度增殖引起的。 嬰兒中血管瘤的發(fā)生率約為4-5%。已有研究證明，許多miRNA在血管瘤中表現(xiàn)異常，如mir-187-3p、mir-424、mir-130a等[6]。miRNA通過作用于基因的3'-非翻譯區(qū)來轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)癌癥的發(fā)展?，F(xiàn)已有研究表明，miR-125b在血管瘤細(xì)胞中下調(diào)[5]。 miR-125b通過抑制許多腫瘤細(xì)胞的增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡而起到抑癌作用，如mir-125b通過靶向A20/NF-κB信號(hào)通路抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡[7]，miR-125b通過靶向MCL1抑制胃癌的增殖和侵襲[8]，microRNA-125b的過表達(dá)通過靶向NF-κB信號(hào)通路抑制人急性髓性白血病細(xì)胞的侵襲、增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]。但是，miR-125b參與嬰兒血管瘤發(fā)展的潛在機(jī)制仍不清楚。本文研究結(jié)果表明，miR-125b在血管瘤中低表達(dá)，其過表達(dá)時(shí)能夠抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞HemECs增殖，并促進(jìn)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞HemECs凋亡。

每個(gè)miRNA具有多個(gè)靶向位點(diǎn)，miR-125b也不例外。已有報(bào)道，MiR-125b-5p通過靶向HK2和抑制PI3K/AKT通路抑制膀胱癌進(jìn)展[10]， miR-125b-5p通過靶向KIAA1522抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[11]。從本文研究結(jié)果可以看出，miR-125b-5p靶向下調(diào)髓樣細(xì)胞白血-1(myeloid cell leukemia-1，MCL-1)。MCL-1是Bcl-2家族的促凋亡成員，通過與Bax和Bak結(jié)合，阻止線粒體外膜通透性，細(xì)胞色素c釋放和活化來保護(hù)細(xì)胞免于凋亡[12]。Mcl-1在幾乎所有惡性腫瘤中均過表達(dá)，例如結(jié)腸癌，肝癌，卵巢癌，胰腺癌和胃癌等，表明MCL-1與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[13]。一些研究顯示，降低MCL-1的表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡并抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，這表明MCL-1是惡性腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)[14]。據(jù)報(bào)道，MCL-1在血管瘤組織中高表達(dá)，姜黃素通過下調(diào)MCL-1和HIF-1α誘導(dǎo)嬰兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡并抑制其增殖[15]。本文研究結(jié)果顯示，MCL-1在血管瘤中高表達(dá)，miR-125b-5p通過靶向下調(diào)MCL-1能夠抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞HemECs增殖，并促進(jìn)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞HemECs凋亡。

AKT / mTOR信號(hào)通路對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖和代謝至關(guān)重要，其在癌癥的發(fā)展過程中也起著非常重要的作用。如，沉默F(xiàn)OLR2基因可通過抑制AKT / mTOR/ S6K1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H1650中細(xì)胞增殖并增加其凋亡[16]。磷酸化的AKT可以直接激活mTOR，也可以通過mTOR Ser2448位點(diǎn)的直接磷酸化來激活mTOR[17]。S6K1是mTOR的重要底物之一，存在于AKT/ mTOR的下游，并起腫瘤細(xì)胞增殖的作用[18]。 已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)AKT / mTOR通路可抑制血管瘤的發(fā)展，如，心得安下調(diào)miR-382可通過pten介導(dǎo)的AKT/mTOR通路抑制嬰幼兒血管瘤的進(jìn)展[19]。本文研究結(jié)果顯示，miR-125b-5p通過靶向下調(diào)MCL-1抑制p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K表達(dá)，說明miR-125b-5p通過靶向下調(diào)MCL-1可能抑制AKT / mTOR通路激活。

綜上所述，miR-125b-5p抑制人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與靶向下調(diào)MCL-1表達(dá)，抑制AKT / mTOR通路激活等有關(guān)，說明miR-125b-5p和MCL-1有望成為血管瘤診斷和治療的潛在生物靶標(biāo)。但本文僅進(jìn)行了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，其動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和具體通路分子機(jī)制還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。