楊 丹， 喬 晶， 王嘉欣， 衛(wèi)無恙， 趙子鑫， 蔡紅艷Δ

(1. 山西醫(yī)科大學微生物學與免疫學教研室， 2. 山西醫(yī)科大學麻醉學院， 3. 山西醫(yī)科大學醫(yī)學影像學院， 太原 030001)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，患者主要臨床表現(xiàn)是進行性學習記憶認知功能障礙和生活能力下降，同時，伴有抑郁等情緒[1]。AD腦內(nèi)典型的病理特征為異常蛋白(β淀粉樣蛋白和過度磷酸化tau蛋白)的蓄積和神經(jīng)元丟失。近年來，國際上成功發(fā)展的APP/PS1/tau三轉(zhuǎn)基因小鼠能夠較好地模擬AD腦內(nèi)典型的病理特征和AD的認知功能障礙及伴隨的情緒改變，已經(jīng)成為AD研究發(fā)病機制和防治藥物篩選公認的動物模型之一[2]。迄今為止，各種抗AD措施的效果都不太理想，有的方法甚至還引起了嚴重的不良反應。因此，尋找新的有效防治AD的方法是亟待解決的問題。

有研究發(fā)現(xiàn)[3]，AD轉(zhuǎn)基因小鼠腸道內(nèi)種植了野生型小鼠的腸道菌群后，其腦內(nèi)較高的β淀粉樣蛋白水平會下降，這說明腸道菌群可能影響著AD的病理發(fā)展。臨床資料表明[4]，AD患者的腸道內(nèi)存在明顯的菌群失調(diào)現(xiàn)象，例如腸道菌群的多樣性下降、不同種屬細菌之間的比例發(fā)生改變等，尤以益生菌的大幅度減少最為顯著。據(jù)文獻報道[5]，補充益生菌可以增強AD動物模型的空間學習記憶能力，并逆轉(zhuǎn)海馬CA1區(qū)長時程增強的缺失。雙歧桿菌屬是腸道重要的益生菌，植入雙歧桿菌屬后，無菌小鼠的認知功能得到了明顯改善[6]。然而，益生菌是活菌，它進入人體后，其中一部分會被消化道內(nèi)的胃液、消化酶等殺滅，到達腸道的數(shù)量會有所減少，使其臨床應用受限。

益生元不會被消化酶所消化，是一種選擇性刺激益生菌生長或提高其活性來改善宿主健康的膳食補充劑，主要包括低聚半乳糖(Galactooligosaccharide, GOS)、低聚果糖等[7,8]。B-低聚半乳糖(Bimuno? Galactooligosaccharides, B-GOS)是一種能夠有效增加雙歧桿菌屬豐度的新型GOS[9]。研究發(fā)現(xiàn)，B-GOS能夠升高皮質(zhì)N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)反應性，改善大鼠的認知靈活性[10]；同時，B-GOS也可以降低成年人的皮質(zhì)醇覺醒反應和一些異常情緒傾向[11]。 以上提示：B-GOS極有可能在AD防治中發(fā)揮積極作用。目前，有關(guān)B-GOS在AD中的研究尚鮮有報道。因此，本研究選用APP/PS1/tau小鼠模型，外源性給予B-GOS，觀察其對APP/PS1/tau小鼠認知行為損傷和抑郁情緒的影響，以期為臨床應用提供實驗資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗選用5月齡雄性APP/PS1/tau小鼠和野生型C57BL/6J 對照小鼠。APP/PS1/tau小鼠購自于美國Jakson實驗室，C57小鼠購自于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。所有小鼠在SPF屏障環(huán)境中繁殖和飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為20～25℃，相對濕度為40%～60%，12 h: 12 h光暗循環(huán)，并保證充足的進食和飲水。

小鼠被隨機分為四組：C57+Vehicle組，C57+B-GOS組，APP/PS1/tau+Vehicle 組和APP/PS1/tau+B-GOS 組，每組10只。B-GOS粉末(Bimuno?, Clasado Biosciences, UK)溶解于無菌水(Vehicle)中，制備成濃度為15 g/L的溶液[12]，給小鼠飲用標準無菌水或B-GOS溶液，連續(xù)給予小鼠5個月，因成年小鼠每日飲水量約為4～7 ml，故小鼠每日攝入B-GOS的劑量約為0.060～0.105 g。行為學期間喂養(yǎng)計劃不變。所有實驗動物的飼養(yǎng)和使用均嚴格遵守國家科學技術(shù)委員會頒布的《實驗動物管理條例》和衛(wèi)生部頒布的 《醫(yī)學實驗動物管理實施細則》。實驗方案獲得山西醫(yī)科大學實驗動物中心動物倫理委員會批準。所有行為學實驗操作步驟均嚴格參照山西省動物倫理協(xié)會指導原則進行。

1.2 曠場實驗

曠場實驗用于評估小鼠的基本運動能力，同時反映小鼠的探索能力。本實驗采用40 cm×40 cm×40 cm的正方體盒子，底部被劃分為16個大小相等的正方形，定義中央四個正方形為中央?yún)^(qū)域，其余為外周區(qū)域。實驗前，將小鼠移入行為學實驗室適應，24 h后依次將每只小鼠放入中央?yún)^(qū)域，讓其自由探索5 min。評價指標為各組小鼠在曠場中5 min運動總距離及其在中心區(qū)域的活動時間百分比。每只小鼠實驗結(jié)束后，用75%乙醇噴灑曠場，并用衛(wèi)生紙擦凈，以避免殘余氣味對下一只小鼠的影響。曠場頂部安裝有紅外攝像頭并和計算機相連接，用于追蹤小鼠軌跡，實驗數(shù)據(jù)由Smart 3.0軟件系統(tǒng)采集分析。

1.3 新物體識別實驗

新物體識別實驗用于評估小鼠對新物體的識別能力。實驗分為熟悉期和測試期。第一階段為熟悉期，在曠場中放入兩個完全相同的物體，兩物體間隔20 cm, 且兩物體到側(cè)壁的距離均為10 cm，依次將每只小鼠從曠場非物體區(qū)域一側(cè)的中線貼壁放入，讓其自由探索10 min后取出，休息6 h后進行測試期實驗。測試期需要將曠場中的其中一個物體取出，換成與其材質(zhì)相同，顏色大小不同的新物體，然后再依次將小鼠從箱體的相同位置放入，自由探索10 min。由曠場中央頂部的紅外線攝像頭追蹤采集小鼠軌跡，軟件分析小鼠探索新物體和舊物體時間，并計算出各組小鼠的新物體識別指數(shù)(NOI)=探索新物體時間/(探索新物體時間+探索舊物體時間)×100%[13]。每只小鼠實驗結(jié)束后，用75%乙醇噴灑箱體和物體，并用衛(wèi)生紙擦凈，以免遺留氣味對下一只鼠的影響。

1.4 Y迷宮實驗

Y迷宮實驗可用來評估小鼠的短期工作記憶能力。Y迷宮宮體由三個完全相同的30 cm×5 cm×15 cm灰色封閉臂構(gòu)成。三臂之間夾角為120°，中間聯(lián)合部分呈一個三角形，在宮體上方正中央安裝有計算機控制的紅外線攝像頭，用來追蹤并采集小鼠軌跡。實驗時，將各組小鼠依次單獨放入三臂交匯處，讓其自由探索8 min。小鼠四肢完全進入臂內(nèi)即判定為進臂，當?shù)谌芜M臂和前兩次均不一樣時，則為正確進臂。手動記錄小鼠進入臂的順序，并統(tǒng)計每只小鼠進臂總次數(shù)及進入正確臂的次數(shù)，最后計算出自發(fā)交替正確率，自發(fā)交替正確率=進入正確臂的次數(shù)/(進臂總次數(shù)-2)×100%[14]。

1.5 Morris水迷宮實驗

經(jīng)典Morris水迷宮可檢測小鼠的長時程空間學習記憶能力。Morris水迷宮是一個由直徑120 cm，高50 cm的圓形不銹鋼宮體和一個直徑為12 cm的內(nèi)置平臺構(gòu)成，在其宮壁貼有四個不同的圖案，位置相互對稱，以便小鼠學習記憶。水迷宮頂部正中安裝有紅外攝像頭，在系統(tǒng)軟件(Noldus Information Technology，荷蘭)輔助下，宮體被等分為四個象限(即為I、II、III、IV象限)。實驗前，將平臺放入第I象限(即為目標象限)，然后向?qū)m體注入水，水面高于平臺1 cm 為宜，并加入鈦白粉混勻，使水溫保持在23℃。經(jīng)典Morris水迷宮實驗的第一階段是定位航行實驗，每天將小鼠從任意象限中點背靠宮體放入水中，讓其自由活動，直到小鼠找到平臺并在平臺上停留5 s。如果60 s內(nèi)小鼠仍未找到平臺，則系統(tǒng)會自動停止，此時人為將這只小鼠誘導至平臺，讓其在平臺停留10 s，20 s間隔后再進行下一個象限的實驗。同時需統(tǒng)計小鼠每一次尋找平臺的逃避潛伏時間，未找到平臺者，其逃避潛伏期記錄為60 s。每只小鼠每天訓練4次，連續(xù)訓練5 d，注意每只小鼠實驗結(jié)束后，需拿毛巾將其身體擦干放回各自籠子中。第二階段為空間探索實驗，在實驗開始的第6日撤掉平臺，隨機選定兩個象限(目標象限除外)，輪流將每只小鼠放進水中，檢測并統(tǒng)計1 min中內(nèi)各組小鼠在目標象限(第I象限)內(nèi)的游泳時間占比和穿越平臺次數(shù)，并獲得它們的游泳軌跡[15]。為了排除整個實驗受小鼠視力和運動能力的影響，在最后一天實驗結(jié)束6 h后，進行可視平臺實驗。實驗前需要經(jīng)水面控制在平臺下1 cm，以確保小鼠在水迷宮中可以看見平臺。隨機選取兩個象限，依次放入小鼠，記錄各組小鼠到達平臺的潛伏時間，并計算各組小鼠的游泳速度。

1.6 懸尾實驗

懸尾實驗用于評價小鼠的抑郁程度。實驗時，用醫(yī)用白色膠帶將小鼠尾端2 cm處固定于懸尾箱頂部，使其腹部朝向攝像頭倒掛于箱內(nèi)，小鼠尾部的懸掛點距懸尾箱底約35 cm。小鼠在倒立狀態(tài)下，不久后便會時而出現(xiàn)類似絕望的靜止狀態(tài)。當小鼠被懸吊起來且完全靜止時被定義為懸尾實驗的不動狀態(tài)。記錄小鼠6 min的不動時間，并計算小鼠后4 min的不動時間百分比。

1.7 強迫游泳實驗

強迫游泳也用來評估小鼠的抑郁程度。將每只小鼠單獨放入直徑為12 cm， 高為25 cm加水的透明圓柱玻璃桶中，桶內(nèi)水面距桶上緣約10 cm。若小鼠沒有掙扎，只有維持將頭部漂浮于水面的必要動作時，這種狀態(tài)即被認為是強迫游泳的不動狀態(tài)。記錄小鼠6 min的不動時間，并計算其后4 min的不動時間百分比。

1.8 恐懼記憶實驗

該實驗用于評估小鼠的恐懼記憶能力。實驗所用的條件恐懼箱是可以根據(jù)系統(tǒng)設置釋放聲波刺激，足底電刺激的長方體箱體，并在箱體底部安裝有壓力傳感器，當小鼠自由活動或接受聲音、電刺激時，隨著足底壓力變化，可以在電腦上顯示隨時間變化的壓力曲線。通過這種方式，可以測得小鼠的不同活動狀態(tài)。整個實驗分為強化訓練期和測試期。

⑴強化訓練期(training session)：首先讓小鼠在箱內(nèi)自由活動90 s，接下來給予持續(xù)30 s的聲音刺激(頻率2 900 Hz、強度90 dB)，在聲音刺激的最后2 s給予直流電刺激(電流強度0.3 mA)。以上聲波刺激和直流電刺激重復5次，每次中間間隔90 s[16]。軟件記錄小鼠整個過程的活動狀態(tài)，并統(tǒng)計各組小鼠強化訓練前后的僵直比率。

⑵測試期(test session)：強化訓練期結(jié)束后24 h，進行測試期。實驗開始前，可以在箱體壁貼上帶顏色的紙，以改變箱體環(huán)境。實驗開始后將小鼠放入箱體適應150 s，軟件記錄小鼠自然狀態(tài)下的活動基線；接著給予150 s的條件刺激(conditioning stimulus, CS)，即不加電刺激強化的聲波刺激(聲波頻率和強度與訓練階段相同)，軟件記錄 CS 期間的活動狀況。分析對比CS作用前后各組小鼠的僵直比率差異。

1.9 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 B-GOS對APP/PS1/tau小鼠探索能力的影響

各組小鼠在曠場中5 min運動總距離無統(tǒng)計學差異(P>0.05，表1)，說明B-GOS對C57小鼠和APP/PS1/tau小鼠的基本運動能力無影響。與C57+Vehicle組小鼠相比，APP/PS1/tau+Vehicle組小鼠在曠場中央?yún)^(qū)域的活動時間百分比明顯減少(P< 0.01)，說明APP/PS1/tau小鼠的探索能力受損；與APP/PS1/tau+Vehicle組小鼠相比，APP/PS1/tau+B-GOS組小鼠在中央?yún)^(qū)域的活動時間百分比顯著增加(P<0.05，圖1)，說明B-GOS能夠提高APP/PS1/tau小鼠的探索能力。

Tab. 1 Effects of B-GOS on the exploratory ability of APP/PS1/tau mice in open field experiment n=10)

Fig. 1 Representative running traces of mice in each group in open field test. The circle with "B" and "E" in the middle represent the starting position and stopping position of mice, respectively. The square frame in the center of the open field is the defined central area

2.2 B-GOS對APP/PS1/tau小鼠新物體識別能力的影響

與C57+Vehicle組小鼠相比，APP/PS1/tau+Vehicle組小鼠的新物體識別指數(shù) NOI顯著降低(P<0.01，表2)；與APP/PS1/tau+Vehicle組小鼠相比，APP/PS1/tau+B-GOS組小鼠的NOI顯著升高(P<0.05)。 結(jié)果說明APP/PS1/tau小鼠的新物體識別能力受損，而B-GOS能夠提高APP/PS1/tau小鼠的新物體識別能力。

Tab. 2 Effects of B-GOS on the recognition ability of new objects in APP/PS1/tau mice n=10)

2.3 B-GOS對APP/PS1/tau小鼠短期工作記憶力的影響

各組小鼠在Y迷宮的進臂總次數(shù)無統(tǒng)計學差異(P>0.05，表3)。與C57+Vehicle組小鼠比較，APP/PS1/tau+Vehicle組小鼠的自發(fā)交替正確率顯著降低(P<0.01)，表明APP/PS1/tau小鼠的短期工作記憶能力受到損害；與APP/PS1/tau+Vehicle組小鼠相比，APP/PS1/tau+B-GOS組小鼠的自發(fā)交替正確率顯著升高(P<0.01)，表明B-GOS能夠增強APP/PS1/tau小鼠的短期工作記憶能力。

Tab. 3 Effects of B-GOS on short-term working memory of APP/PS1/tau mice in Y maze n=10)

2.4 B-GOS對APP/PS1/tau小鼠長時程空間學習記憶力的影響

在經(jīng)典Morris水迷宮的定位航行實驗中，隨著訓練時間的延長，各組小鼠找到平臺的逃避潛伏期均逐漸縮短(P<0.05，表4)。在第4日和第5日，與C57+Vehicle組小鼠的逃避潛伏期相比，APP/PS1/tau+Vehicle組小鼠的逃避潛伏期顯著延長(P< 0.01)，表明APP/PS1/tau小鼠的長時程空間學習能力受到損害；與APP/PS1/tau+Vehicle組小鼠比較，APP/PS1/tau+B-GOS組小鼠第4日和第5日的逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05)，表明B-GOS能夠增強APP/PS1/tau小鼠的長時程空間學習能力。在空間探索實驗中(表5)。與C57+Vehicle組小鼠相比，APP/PS1/tau+Vehicle組小鼠的目標象限游泳時間百分比顯著降低(P<0.01，圖2)，穿越平臺次數(shù)顯著減少(P<0.01)，說明APP/PS1/tau小鼠的長時程空間記憶能力受損；與APP/PS1/tau+Vehicle組小鼠相比，APP/PS1/tau+B-GOS組小鼠的目標象限游泳時間百分比及穿越平臺次數(shù)顯著增加 (P<0.01)，說明B-GOS能夠增強APP/PS1/tau小鼠的長時程空間記憶能力。在可視平臺實驗中，各組小鼠到達平臺的時間和游泳速度均無統(tǒng)計學差異(P>0.05，表5)，排除了各組小鼠的基本運動能力和視力的差異。

Tab. 4 Effects of B-GOS on long-term spatial learning and memory of APP/PS1/tau mice in Morris water maze during positioning navigation phase n=10)

Tab. 5 Effects of B-GOS on long-term spatial learning and memory of APP/PS1/tau mice in Morris water maze during the space exploration phase and visual platform phase n=10)

Fig. 2 Typical swimming track of mice in each group on during the space exploration phase

2.5 B-GOS對APP/PS1/tau小鼠抑郁情緒的影響

在懸尾實驗中，與C57+Vehicle組小鼠相比，APP/PS1/tau+Vehicle組小鼠的不動時間百分比顯著升高(P<0.01，表6)；與APP/PS1/tau+Vehicle組小鼠相比，APP/PS1/tau+B-GOS組小鼠的不動時間百分比顯著下降(P<0.01)。在強迫游泳實驗中，與C57+Vehicle組小鼠相比，APP/PS1/tau+Vehicle組小鼠的不動時間百分比顯著增高(P<0.01)；與APP/PS1/tau+Vehicle組小鼠相比，APP/PS1/tau+B-GOS組小鼠的不動時間百分比顯著減少(P< 0.01)。 以上結(jié)果表明：APP/PS1/tau小鼠具有明顯的抑郁傾向，而B-GOS能夠緩解APP/PS1/tau小鼠的抑郁情緒。

Tab. 6 Effects of B-GOS on depression in APP/PS1/tau mice in tail suspension test and forced swimming test n=10)

2.6 B-GOS對APP/PS1/tau小鼠恐懼記憶力的影響

結(jié)果表明，在訓練開始與結(jié)束時各組小鼠的僵直比率沒有統(tǒng)計學差異 (P>0.05，表7)，表明各組小鼠的恐懼學習過程無差別。在測試階段，條件刺激(CS)作用前，各組小鼠的僵直比率沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)；CS刺激后，APP/PS1/tau+Vehicle組小鼠的僵直比率顯著低于C57+Vehicle 組小鼠(P<0.01)，與APP/PS1/tau+Vehicle組小鼠相比，APP/PS1/tau+B-GOS組小鼠的僵直比率顯著升高(P< 0.01)。結(jié)果表明：APP/PS1/tau小鼠的恐懼記憶能力受到損害，而B-GOS能夠改善其恐懼記憶能力障礙。

Tab. 7 Effects of B-GOS on fear memory of APP/PS1/tau mice in conditional fear box (%, n=10)

3 討論

AD患者腸道菌群紊亂以雙歧桿菌屬豐度顯著降低為主要特點。GOS被稱為是雙歧桿菌屬的生長因子。B-GOS是從Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171中分離的半乳糖苷酶的催化而產(chǎn)生的一種新型的GOS[17]。B-GOS對酸和熱具有高穩(wěn)定性，可作為誘騙受體阻止致病菌在腸道表皮細胞上的粘附，保護腸道免受致病菌的入侵[18]。發(fā)酵實驗顯示：與其他類型的GOS相比，B-GOS能更大程度地刺激雙歧桿菌屬的增殖，表現(xiàn)出較高的生長率[9]。資料表明：B-GOS可以增強老年人的免疫力[19]，在肥胖人群的代謝疾病方面起到很好的治療作用[20]。本研究重點探討B(tài)-GOS在AD中的神經(jīng)保護效應。

AD是以認知功能改變?yōu)橹饕卣鞯闹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)退行性疾病，常伴有抑郁等情緒異常。本研究觀察B-GOS對APP/PS1/tau小鼠認知行為損傷和抑郁情緒的干預作用。在整個實驗過程中，保持室內(nèi)燈光、溫度和濕度不變，排除實驗環(huán)境的干擾；飼養(yǎng)員和實驗員固定，排除人為因素。行為學實驗按照由弱到強的刺激強度依次進行，盡可能減少了各實驗之間的相互影響，以保證實驗數(shù)據(jù)的可靠性。本實驗選用了曠場實驗，新物體識別實驗、Y 迷宮實驗、經(jīng)典Morris水迷宮實驗和條件恐懼實驗，較全面、評估觀察了B-GOS對APP/PS1/tau轉(zhuǎn)基因小鼠認知障礙的影響；采用了懸尾實驗和強迫游泳實驗來評價B-GOS改善APP/PS1/tau小鼠抑郁情緒的程度。需要指出的是：各組小鼠在曠場實驗中的運動總距離、Y迷宮實驗中的進臂總次數(shù)和Morris水迷宮實驗中尋找可視平臺的時間及游泳速度均無統(tǒng)計學差異，說明各組小鼠的基本運動能力和視力無差別，保證了實驗數(shù)據(jù)的準確性。認知行為實驗結(jié)果顯示：與C57對照小鼠相比，APP/PS1/tau小鼠的探索能力(曠場實驗)、新物體識別能力(新物體識別實驗)、短期工作記憶能力(Y迷宮實驗)、長時程空間學習記憶能力(經(jīng)典Morris水迷宮)和恐懼記憶能力(條件恐懼實驗)均受到損害；而B-GOS處理后，APP/PS1/tau小鼠的認知行為損傷得到了較大程度的逆轉(zhuǎn)。研究資料表明[10]：B-GOS能夠誘導皮質(zhì)NMDAR電生理反應增強，限制了與NMDAR相關(guān)的認知功能惡化；母體補充B-GOS能夠降低海馬谷氨酸受體基因的表達，增加了年輕斷奶子代的探索行為[21]；B-GOS還提高了嚙齒類動物的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)水平。這些先前的實驗均可間接解釋本實驗所觀察到B-GOS的神經(jīng)保護效應。抑郁情緒實驗結(jié)果顯示：與C57對照小鼠相比，APP/PS1/tau小鼠在懸尾實驗和強迫游泳實驗中表現(xiàn)出較強的抑郁傾向；而B-GOS干預后，APP/PS1/tau小鼠抑郁情緒的程度有所減輕。實驗研究顯示：B-GOS通過增加小鼠腦內(nèi)5-HT2受體，使小鼠炎癥后的焦慮和抑郁情緒有所緩解[22]；與本實驗觀察到的B-GOS抗抑郁情緒的效應是一致的。本研究結(jié)果為進一步探尋防治AD的有效措施具有一定的應用意義。

本研究在動物行為學水平上，證實B-GOS在AD中的神經(jīng)保護作用。后續(xù)將進一步探索B-GOS發(fā)揮神經(jīng)保護效應的電生理機制，為將B-GOS用于AD防治的臨床轉(zhuǎn)化提供理論依據(jù)。