陳 郁， 高 亮， 龔 亮， 陳興書， 陽盛洪， 羅勇軍△

(1. 陸軍軍醫(yī)大學(xué)陸軍衛(wèi)勤訓(xùn)練基地軍事醫(yī)學(xué)地理學(xué)教研室， 重慶 400038； 2. 解放軍第950醫(yī)院， 新疆 葉城 844900；3. 解放軍第949醫(yī)院， 新疆 阿勒泰 836300)

高血壓作為心血管事件重要的危險因素，影響了全世界大約30%的人群身體健康[1, 2]，而遺傳因素在高血壓的發(fā)生過程中發(fā)揮著顯著作用，核基因和線粒體基因均參與其中[3, 4]。研究表明，線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)變異與高原適應(yīng)和高原疾病有關(guān)[5-7]，但是其在高原原發(fā)性高血壓(high altitude essential hypertension, HAEH)發(fā)生中的作用尚不十分清楚。近年來，越來越多的研究表明mtDNA變異與高血壓的發(fā)生有關(guān)，包括mtDNA7492C、15927G[8]、4401A、5821G[9]及4263A[10]等，表明mtDNA變異是高血壓發(fā)生的原因之一，其引起的異常調(diào)控變化在高血壓的潛在發(fā)生機(jī)制。中國塔吉克族世代生活在塔什庫爾干縣，位于帕米爾高原東部，平均海拔在4 000 m以上。流行病學(xué)調(diào)查提示，中國塔吉克族的高血壓發(fā)病率較高，遠(yuǎn)高于全國平均水平，但其中的原因和機(jī)制仍不清楚[11]。塔吉克族很少與外族通婚，遺傳資源受外界干擾程度低，這為分析HAEH的致病基因提供了很好的遺傳基礎(chǔ)。上述研究提示，mtDNA變異極有可能參與了塔吉克族HAEH的發(fā)生。為從mtDNA角度探索塔吉克族HAEH的遺傳基礎(chǔ)，本研究擬通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)擴(kuò)增mtDNA片段，并經(jīng)過拼接獲得線粒體全基因組序列，結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)分析mtDNA堿基突變和單倍群變異在HAEH中的特點(diǎn)，分析mtDNA變異在中國塔吉克族HAEH中的作用，以進(jìn)一步豐富對HAEH發(fā)生的認(rèn)識，尋找潛在的治療靶點(diǎn)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

在新疆喀什地區(qū)的塔什庫爾干縣的中國塔吉克族人群中，收集了53例HAEH患者和46例高原健康者作為對照。病例的入選標(biāo)準(zhǔn)為：收縮壓不低于140 mmHg，和/或舒張壓不低于90 mmHg，并排除其他疾病所致的繼發(fā)性高血壓等情況。對照組為高原健康塔吉克族個體。

1.2 DNA提取

每名受試者取靜脈全血2 ml，經(jīng)EDTA-K2抗凝處理后，采用OMEGA全血基因組提取試劑盒(D3392-02,Omega Bio-tek, USA)提取全血DNA，經(jīng)NanoDrop-2000測定DNA濃度后，分裝存于-20℃?zhèn)溆肹12]。

1.3 線粒體DNA擴(kuò)增和拼接

參照J(rèn)iang[7]的方法，根據(jù)mtDNA的劍橋參考序列，分別設(shè)計(jì)不同的擴(kuò)增引物和測序引物，將mtDNA分段擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序后拼接，最終獲得每個受試者的線粒體基因組序列。所得序列使用mtDNA序列在線分析工具M(jìn)itoTool (http://mitotool.kiz.ac.cn/)與劍橋標(biāo)準(zhǔn)序列(NC_012920)對比[13]，以獲得每個個體的線粒體單倍群和mtDNA變異位點(diǎn)。利用Mitomap數(shù)據(jù)庫(https://www.mitomap.org//MITOMAP)[14]對mtDNA變異位點(diǎn)進(jìn)行檢索，獲取其相應(yīng)的基因定位和生物學(xué)功能，對涉及氨基酸變異的位點(diǎn)納入后期生物信息學(xué)預(yù)測當(dāng)中。

1.4 生物信息學(xué)預(yù)測mtDNA所致氨基酸變異和功能改變

為進(jìn)一步研究mtDNA變異所致的功能變化，本研究通過多種生物信息學(xué)在線軟件探索mtDNA變異導(dǎo)致HAEH的可能機(jī)制。對具有明顯分布差異的錯義突變位點(diǎn)，在NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中檢索其所在蛋白質(zhì)序列編號，并用一系列生物信息學(xué)軟件分析變異所致的潛在功能變化，包括： Protparam(http://web.expasy.org/protparam)[15]分析突變前后的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)變化，ProtScale(http://web.expasy.org/protscale)[16]分析突變前后的親/疏水性變化，TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)[17]分析蛋白跨膜螺旋結(jié)構(gòu)變化，Psipred 4.0(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)[18]和PredictProtein軟件(https://www.predictprotein.org/)[19]預(yù)測變異前后蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化，Swiss-Model(http://swissmodel.expasy.org)[20]預(yù)測變異前后蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)變化，以及NCBI的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫預(yù)測變異前后的蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 HAEH組和對照組基本情況的比較

HAEH組和對照組的基本信息見表1，可見HAEH組和對照組的年齡和性別比存在顯著差異。為了平衡年齡和性別差異，本研究采用二分類的logistic回歸分析來校正年齡和性別差異。

Tab. 1 Characteristics of subjects in HAEH and size)

2.2 HAEH組和對照組中mtDNA單倍群分布的比較

經(jīng)與MitoTool在線軟件對比后，獲得所有受試者的mtDNA單倍群類型。HAEH組和對照組的單倍群分布具體如下(表2)。

Tab. 2 Haplogroup distribution between HAEH and control

流行病學(xué)指出，優(yōu)勢比(odds ratio, OR)是暴露人群發(fā)病優(yōu)勢與非暴露人群發(fā)病優(yōu)勢之比，在logistic回歸分析中，當(dāng)OR值>1，P<0.05，提示該研究因素為危險因素(易感因素)。和對照組相比，HAEH組中U4單倍群的頻率顯著升高(P=0.023<0.05，OR=7.062，95%CI=1.306-38.182)，表明U4單倍群會顯著增加中國塔吉克族人群罹患HAEH的易感性。經(jīng)MitoTool數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，所有U4單倍群的個體均隸屬于U4b單倍群。經(jīng)logistic回歸校正年齡后，U4b單倍群在HAEH組和對照組之間分布差異的顯著性P值為0.000, OR=1.071, CI=1.032-1.110；校正性別后，U4b單倍群在HAEH組和對照組之間分布差異的顯著性P值為0.023, OR=5.351, CI=1.257-22.773。上述結(jié)果表明，即便校正年齡和性別之后，U4b單倍群依然是中國塔吉克人群HAEH的危險因素。

2.3 mtDNA變異在HAEH組和對照組分布的比較

經(jīng)與劍橋序列對比，獲取每名受試者mtDNA基因組中的每個位點(diǎn)的變異情況。前面分析的結(jié)果提示， U4b單倍群的分布具有顯著差異，故在分析mtDNA各個位點(diǎn)的頻率分布時，僅針對U4b單倍群的標(biāo)簽位點(diǎn)，結(jié)果見表3。在U4b的標(biāo)簽位點(diǎn)中，mtDNA的499、4646、5999、6047、7705、11332、15693和16356位點(diǎn)的基因型變異頻率在HAEH組顯著升高(499、4646、5999、6047、7705、15693和16356位點(diǎn)：P=0.023<0.05，OR=7.062，95%CI=1.306-38.182；11332位點(diǎn)：P=0.031<0.05，OR=6.573，95%CI=1.193-36.216)，和對照組之間存在顯著差異，提示攜帶上述位點(diǎn)的基因型變異可能提高塔吉克族罹患HAEH的風(fēng)險。

Tab. 3 Distribution of tag position of mtDNA haplogroup U4b between HAEH and control

2.4 陽性mtDNA關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的功能預(yù)測

結(jié)果2.3表明，mtDNA的U4b單倍群的8個標(biāo)簽位點(diǎn)在HAEH組和對照組的分布有著顯著差異。經(jīng)與MitoTool在線軟件對比，并參閱Mitomap數(shù)據(jù)庫后發(fā)現(xiàn)僅mtDNA15693T>C變異會導(dǎo)致氨基酸變化。該位點(diǎn)位于mtDNA的Cytb基因中，并編碼第316位氨基酸，編碼蛋白是線粒體CYB蛋白(復(fù)合體Ⅲ)的重要結(jié)構(gòu)。當(dāng)由T突變?yōu)镃時，氨基酸由蛋氨酸變異為蘇氨酸。由于氨基酸變異直接導(dǎo)致蛋白質(zhì)及結(jié)構(gòu)的變化，可能會進(jìn)一步導(dǎo)致蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的變化而影響蛋白功能。為進(jìn)一步評估m(xù)tDNA15693T>C變異可能導(dǎo)致的功能變化，本研究通過生物信息學(xué)在線預(yù)測軟件實(shí)現(xiàn)。

2.4.1 CYB和CYB(M316T)蛋白理化性質(zhì)、親疏水性和跨膜結(jié)構(gòu)變化 在查閱NCBI的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫后，獲取CYB蛋白全氨基酸序列，并將第316位氨基酸從蛋氨酸變異為蘇氨酸之后，經(jīng)Protparam、ProtScale和TMHMM 2.0軟件分析，變異前后Cytb蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、親疏水性和跨膜結(jié)構(gòu)無顯著影響。

2.4.2 CYB蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 經(jīng)PisPred預(yù)測，CYB蛋白中各二級結(jié)構(gòu)類型分布所占百分比為α螺旋66.84%，β折疊2.37%，無規(guī)卷曲30.79%，發(fā)生M316T突變之后其二級結(jié)構(gòu)構(gòu)成比例變?yōu)棣谅菪?7.63%，β折疊2.37%，無歸卷曲30.00%。變異后其二級結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生改變，仍是屬于Coil區(qū)域。

然而，由于CYB蛋白的第316號氨基酸發(fā)生了改變，由疏水的非極性氨基酸蛋氨酸變成了親水性的極性氨基酸蘇氨酸，這可能改變其二級結(jié)構(gòu)的親疏水性，甚至有可能對其二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。經(jīng)PredictProtein預(yù)測后發(fā)現(xiàn)，在該位點(diǎn)氨基酸突變后會形成一個新的磷酸化位點(diǎn)，即TFR(蘇氨酸、苯丙氨酸、精氨酸組合的氨基酸序列)的一個蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，這個位點(diǎn)會導(dǎo)致蛋白磷酸化的Vmax和Km值都增加，結(jié)合CYB的功能推測，該磷酸化位點(diǎn)的形成可能會影響線粒體磷酸化和電子傳遞鏈的功能。

3 討論

高血壓是誘導(dǎo)惡性心血管事件的重要因素，而在高原地區(qū)經(jīng)歷寒冷低氧等刺激后，血壓的波動更為劇烈，容易出現(xiàn)不良結(jié)局，對人體造成的危害也更為嚴(yán)重，因而深入研究高原血壓異常的發(fā)病機(jī)制和防治策略對維護(hù)高原居民健康、推動高原地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展有著重要意義。有關(guān)mtDNA變異與中國塔吉克族HAEH發(fā)生的關(guān)系研究鮮有報(bào)道。在本研究中發(fā)現(xiàn)，mtDNA的U4b單倍群是中國塔吉克族罹患HAEH的危險因素。其中，U4b單倍群的標(biāo)簽位點(diǎn)，即mtDNA499、4646、5999、6047、7705、11332、15693和16356的基因型分布在HAEH組和對照組之間存在顯著差異。除了mtDNA15693位點(diǎn)外，其他有差異的位點(diǎn)均不導(dǎo)致氨基酸變異。mtDNA15693T>C變異會導(dǎo)致CYB蛋白第316號氨基酸由蛋氨酸變?yōu)樘K氨酸，經(jīng)生物信息學(xué)軟件預(yù)測該突變誘導(dǎo)形成了一個新的蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，可能與HAEH的發(fā)生有關(guān)。

分布有差異的U4b單倍群標(biāo)簽位點(diǎn)中，499和16356位點(diǎn)在mtDNA的D-loop區(qū)，而其他位點(diǎn)都位于基因編碼區(qū)。mtDNA15693位于編碼CYB蛋白的基因中，其T→C變異是一個高度保守性的致病性突變，可能與女性的左室心肌致密化不全有關(guān)[21]。此外，研究發(fā)現(xiàn)CYB蛋白結(jié)構(gòu)和功能變化會導(dǎo)致女性動脈粥樣硬化，而這也是高血壓發(fā)生的重要原因[22]。mtDNA15059G→A變異與原發(fā)性高血壓有關(guān)，該位點(diǎn)也位于編碼CYB蛋白的區(qū)域內(nèi)[23]。上述研究表明，CYB蛋白的結(jié)構(gòu)和功能變化與高血壓的發(fā)生密切相關(guān)。本研究中發(fā)現(xiàn)的mtDNA15693T>C變異雖然并未導(dǎo)致CYB蛋白的二級結(jié)構(gòu)變化，但新形成了一個蛋白激酶C的磷酸化位點(diǎn)。蛋白激酶C不僅可以與5-羥色胺和5-羥色胺2A受體結(jié)合[24]，還可以推動腎上腺素能激動劑和腎上腺素α1受體的結(jié)合[25]。α1受體主要分布在血管和突觸前膜上，興奮時引起血管收縮，而這也是高血壓發(fā)生的重要機(jī)制之一。因此，mtDNA15693T>C變異通過誘導(dǎo)形成一個新的蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，可能加強(qiáng)蛋白激酶C的磷酸化功能，但是中間涉及的環(huán)節(jié)較多，其如何誘導(dǎo)HAEH的發(fā)生還有待于深入的分子機(jī)制研究。

本研究還是采用的PCR片段擴(kuò)增，產(chǎn)物測序并拼接以獲取mtDNA全部序列，也就是傳統(tǒng)的Sanger測序(一代測序)。Sanger測序準(zhǔn)確率高，是基因檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，然而其主要作用在于確定基因型，并不能檢測出低拷貝型的嵌合體。在實(shí)驗(yàn)過程中也發(fā)現(xiàn)，上述操作較為繁瑣，而且相鄰片段之間存在交叉，需要在拼接時對比劍橋序列進(jìn)行剪切以排除重復(fù)序列。在拼接和對比時容易出現(xiàn)失誤以致影響序列的準(zhǔn)確性。伴隨著測序技術(shù)的發(fā)展，二代以及三代測序已經(jīng)發(fā)展得較為成熟可靠，雖然其測序的準(zhǔn)確性不如一代測序，但是其快速、高通量、多重測序深度的特點(diǎn)可以有效降低測序中出現(xiàn)的錯誤，并且也能分析出低拷貝型的嵌合體。針對Sanger測序和二代、三代測序的優(yōu)缺點(diǎn)，在不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中分別組合利用，能夠有效獲取mtDNA的全部序列，為全面分析其所攜帶的遺傳信息提供技術(shù)支持。

本研究中樣本量較少，性別和年齡并不匹配，并且由于實(shí)驗(yàn)條件限制并未開展功能實(shí)驗(yàn)。在后續(xù)研究中，將繼續(xù)從mtDNA角度探討中國塔吉克族HAEH的發(fā)生機(jī)制，一方面擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步平衡性別和年齡差異，采用高通量測序方法檢測mtDNA的變異，另一方面通過細(xì)胞和分子實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證mtDNA變異在HAEH發(fā)生中的作用。

綜上所述，本研究表明線粒體單倍群U4b是中國塔吉克族HAEH的遺傳易感因素，攜帶mtDNA15693C基因型的個體可顯著增加罹患HAEH的風(fēng)險。功能預(yù)測提示該變異會誘導(dǎo)CYB蛋白形成一個新的蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，但是并不會引起CYB蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化。深入探討mtDNA在HAEH中的作用，將進(jìn)一步從線粒體角度豐富對高原血壓異常的認(rèn)識，為高原血壓異常的防治提供新的治療思路和靶點(diǎn)。