張進強，易賽妮，申琳敏，李良遠，肖承鴻，唐鑫，劉芹，蘇大鵬，胥春云，周濤

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

神經(jīng)干細胞是一類具有自我更新、分裂及多向分化能力的干細胞亞群，廣泛存在于哺乳動物腦內(nèi)的嗅球、海馬齒狀回、大腦皮層等部位，是構(gòu)成神經(jīng)發(fā)生的重要細胞基礎(chǔ)[1-2]。傳統(tǒng)認為神經(jīng)發(fā)生過程只存在于胚胎發(fā)育過程中，在哺乳動物成年后，神經(jīng)發(fā)生過程便會停止。但近年的研究發(fā)現(xiàn)，成年哺乳動物的海馬顆粒細胞下層區(qū)和室管膜下區(qū)存在一定數(shù)量的神經(jīng)干細胞，在特定條件下，這些神經(jīng)干細胞可分化為神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞，從而參與神經(jīng)功能的修復(fù)過程[3]。已有研究證明，成年哺乳動物的神經(jīng)發(fā)生在腦損傷、腦缺血、癲癇和抑郁、阿爾茨海默病等疾病的治療中發(fā)揮了積極的作用，藥理學(xué)調(diào)控神經(jīng)干細胞功能可為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療開辟新的研究領(lǐng)域[4-5]。

馬錢子苷(Loganin)為常用中藥山茱萸(CornusofficinalisSieb.et Zucc.)的主要活性成分，又名馬錢素、番木鱉苷，屬于環(huán)烯醚萜類化合物，已發(fā)現(xiàn)其有良好的抗炎、免疫調(diào)節(jié)及神經(jīng)保護作用[6]。本實驗基于馬錢子苷對神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，從成年小鼠大腦中分離培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，觀察不同濃度的馬錢子苷對神經(jīng)干細胞增殖、存活和分化的影響，為神經(jīng)干細胞治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究奠定理論和實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

成年C57BL/6J小鼠(8周齡)購自湖南省長沙市天勤生物技術(shù)有限公司(質(zhì)量合格證號SCXK(湘)2019-0014)；DMEM/F12高糖培養(yǎng)基(貨號：12400-024)、表皮生長因子蛋白EGF(貨號：PHG0311)、N 2 Supplement(貨號：17502048)、B-27添加劑(貨號：17504-044)購自美國Gibco公司；細胞生長因子FGF(貨號：13256029)購自美國Invitrogen公司；抗支原體試劑(貨號：1944020)、青鏈霉素混合液(貨號：P1400)購自北京索萊寶科技有限公司；GFAP抗體(貨號：80788S)、MAP2抗體(貨號：8707S)、BrdU抗體(貨號：5292S)購自美國Cell Signaling Technology公司；Olig 2抗體(貨號：ab236540)購自美國Abacm公司；馬錢子苷(貨號：FY1475，純度98%)、水合氯醛(貨號：302-17-0)購自四川生物工程有限公司。

1.2 神經(jīng)干細胞的分離與培養(yǎng)

成年C57BL/6J小鼠用水合氯醛麻醉，用75%的乙醇浸泡消毒10 s，于超凈工作臺中頸椎脫臼處死，取出完整大腦放入裝有無菌PBS的培養(yǎng)皿中，剝?nèi)ツX膜，保留神經(jīng)干組織轉(zhuǎn)移至裝有無菌PBS的培養(yǎng)皿中，吹打，使組織分散后移至15 mL離心管內(nèi)，500 r/min離心2 min，棄上清，迅速加入0.25%胰酶細胞消化液1 mL，于37 ℃水浴鍋中消化5 min，加入胎牛血清終止消化，1200 r/min離心5 min，棄上清，加入6 mL增殖培養(yǎng)基(含有94.29% DMEM/F12高糖、1.94% B-27、0.97% N2、20 ng/mL的EGF、FGF各0.19%、1.21%雙抗和1.21%抗支原體試劑)。將細胞懸液稀釋到1×105并接種于24孔板中,放入37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天利用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況并拍照記錄。

1.3 神經(jīng)干細胞增殖培養(yǎng)及藥物處理

收集生長狀態(tài)良好的第二代神經(jīng)干細胞球，500 r/min離心3 min，棄上清，加1 mL胰酶吹打，5 min后加入3 mL DMEMF12，1000 r/min離心5 min，去上清，加入增殖培養(yǎng)基至6 mL，接種于24孔板中，放入37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞分為4個組，分別為空白組(用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng))、馬錢子苷處理組(濃度分別為50、100、200 μmol/L 3組)。每組3個復(fù)孔，連續(xù)7 d觀察并拍照記錄各組神經(jīng)球的直徑和數(shù)量。

1.4 神經(jīng)干細胞分化培養(yǎng)及藥物處理

收集生長狀態(tài)良好的第二代神經(jīng)干細胞球，500 r/min離心3 min，棄上清，加入3 mL分化培養(yǎng)基(含89.9% DMEM/F12高糖、0.9% N2、1.8% B-27、1.2% 雙抗、1.2% 抗支原體、5% 驢血清)吹打，1000 r/min離心5 min，去上清，加入分化培養(yǎng)基至6 mL，接種于24孔板中，放入37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞分為4個組，分別為空白組(用分化培養(yǎng)基培養(yǎng))、馬錢子苷處理組(濃度分別為50 、100、200 μmol/L 3組)，每2 d進行半量換液，吸除各孔500 μL分化培養(yǎng)基，再各加500 μL新的分化培養(yǎng)基。每組3個復(fù)孔，連續(xù)觀察，7 d后進行免疫熒光染色。

1.5 細胞固定及免疫熒光染色

在神經(jīng)干細胞有絲分裂研究中，神經(jīng)干細胞培養(yǎng)6.5 d后，用100 ng/mL的5-溴-2-脫氧脲苷(BrdU)處理神經(jīng)干細胞，12 h后進行細胞固定。在分化研究中，分化培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞在培養(yǎng)第7 d進行固定。細胞固定時，吸棄24孔板中的分化培養(yǎng)基，各孔中加500 μL 4%多聚甲醛固定30 min，加入300 μL的0.5%的TritonX-100通透15 min，加300 μL的10% 驢血清封閉1 h，吸去驢血清，每孔加一抗(BrdU、MAP 2、GFAP、Olig 2)，4 ℃孵育過夜。24 h后PBS洗滌3次，每次3 min，避光下加入二抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3次，最后滴加5 μL抗熒光衰減封片劑，取出載玻片，用蓋玻片覆蓋，在激光共聚焦電子顯微鏡下觀察。

1.6 顯微成像及圖片分析

將分化培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞空白組和給藥馬錢子苷組中的3個復(fù)孔各選具有代表性的5個視野連續(xù)7 d拍照并觀察細胞生長情況。培養(yǎng)7 d后分化的神經(jīng)干細胞經(jīng)免疫熒光染色送往Servicebio公司進行普通切片掃描(熒光雙標(biāo)，三色)。將切片掃描后的圖片經(jīng)過CaseViewer軟件打開，空白組和馬錢子苷組的各3個復(fù)孔均選取5個具代表性視野截屏，然后借助ImageJ軟件計數(shù)并統(tǒng)計。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及顯著性分析

2 結(jié)果與分析

2.1 馬錢子苷對神經(jīng)干細胞增殖和存活的影響

將培養(yǎng)的成年神經(jīng)干細胞分離成單細胞，細胞邊緣具有折光性(圖1(a))。分離培養(yǎng)3 d的神經(jīng)干細胞是由5～25個單細胞聚集而成的球形(圖1(b))；分離培養(yǎng)5 d后，神經(jīng)干細胞由12～65個單細胞聚集而成，體積相對增大，神經(jīng)球邊緣較規(guī)整(圖1(c))；分離培養(yǎng)7 d后，神經(jīng)干細胞由20～110個單細胞聚集而成神經(jīng)球，體積大，神經(jīng)球直徑約150 μmol/L，邊緣規(guī)整且折光性強。

圖1 成年小鼠神經(jīng)干細胞純化Fig.1 Purification of adult mouse neural stem cells

在不同濃度馬錢子苷干預(yù)下，增殖培養(yǎng)1 d和3 d的神經(jīng)干細胞細胞直徑和神經(jīng)球數(shù)量與對照組相比均無明顯差異(P>0.05)(圖2(a)、2(b))；神經(jīng)干細胞在含有低、中、高濃度(50、100、200 μmol/L)馬錢子苷的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d后，各組神經(jīng)球的直徑均明顯變大(P<0.05)，其中，馬錢子苷低、中、高劑量組的神經(jīng)球直徑分別增加了28.0%、30.4%、41.6%，與此同時，馬錢子苷中、高劑量組中神經(jīng)干細胞成球的數(shù)量在培養(yǎng)5 d后與對照相比也顯著增加(P<0.05)，分別增加了53.8%和34.6%；而低劑量組的神經(jīng)球數(shù)量與對照相比無明顯變化(P>0.05)(圖2(c))。神經(jīng)干細胞在含有低、中、高濃度馬錢子苷的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后，各組神經(jīng)球的直徑與對照相比進一步增大(P<0.05)，神經(jīng)球直徑分別增加了20.6%、33.3%、46.6%，與此同時，馬錢子苷低、中、高劑量組中神經(jīng)干細胞成球的數(shù)量在培養(yǎng)7 d后與對照相比也顯著增加(P<0.05)，分別增加了44.4%、66.6%和63.8%(圖2(d))。

注：A～D為增殖培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞顯微圖；E和F為增殖培養(yǎng)的神經(jīng)球直徑及數(shù)量統(tǒng)計圖；CK為對照組，數(shù)據(jù)顯示為*P<0.05，**P<0.01 ,***P<0.005 相比CK組,單因素方差分析。圖2 馬錢子苷干預(yù)對神經(jīng)干細胞增殖和存活的影響Fig.2 Effects of Loganin on the proliferation and survival of neural stem cells

2.2 馬錢子苷對神經(jīng)干細胞有絲分裂的影響

單細胞增殖活性檢測結(jié)果顯示，神經(jīng)干細胞在含有中、高劑量馬錢子苷的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后，完成有絲分裂的神經(jīng)干細胞(BrdU陽性標(biāo)記)的細胞數(shù)量與對照組相比有顯著增加(P<0.05)，而低劑量組的BrdU陽性標(biāo)記的神經(jīng)干細胞數(shù)量與對照相比無明顯變化(P>0.05)(圖3)。

注：A～D，有絲分裂后的神經(jīng)干細胞的免疫熒光染色圖，BrdU(綠色)標(biāo)記完成有絲分裂后的細胞，DAPI(藍色)標(biāo)記所有細胞核；E為各組中完成有絲分裂的神經(jīng)干細胞占總細胞的百分比；CK為對照組，數(shù)據(jù)顯示為相比CK組，單因素方差分析。圖3 馬錢子苷干預(yù)對神經(jīng)干細胞有絲分裂的影響Fig.3 Effects of Loganin on the caryomitosis of neural stem cells

2.3 馬錢子苷對神經(jīng)干細胞分化的影響

神經(jīng)干細胞在含有低、中、高濃度馬錢子苷的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后，采用免疫細胞化學(xué)染色檢驗神經(jīng)干細胞的分化情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，低劑量馬錢子苷處理組的神經(jīng)干細胞發(fā)生分化的比率由60.3%增加到74.5%(P<0.01)，而未分化的神經(jīng)干細胞的比例由39.7%減少到25.5%(P<0.01)；而馬錢子苷中、高劑量組的神經(jīng)干細胞分化率被顯著抑制(P<0.05)，未分化的神經(jīng)干細胞的比例顯著升高(P<0.05)(圖4)。

注：CK為對照組，數(shù)據(jù)顯示為*P<0.05，**P<0.01 相比 CK組，單因素方差分析。圖4 馬錢子苷干預(yù)對神經(jīng)干細胞分化的影響Fig.4 Effects of Loganin on the differentiation of neural stem cells

2.4 馬錢子苷對神經(jīng)再生的影響

神經(jīng)干細胞在含有低、中、高濃度馬錢子苷的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后，采用免疫細胞化學(xué)染色檢驗神經(jīng)再生情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，低劑量馬錢子苷處理后，MAP2標(biāo)記的細胞(神經(jīng)元)數(shù)量及比例顯著增加(P<0.01)，馬錢子苷中劑量組的MAP2標(biāo)記的細胞數(shù)量及比例無明顯變化(P>0.05)，馬錢子苷高劑量組的MAP2標(biāo)記的細胞數(shù)量及比例顯著減少(P<0.05)(圖5)。

注：A1～D2為神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化的免疫熒光染色圖，MAP2(紅色)標(biāo)記神經(jīng)元，DAPI(藍色)標(biāo)記所有細胞核；E和F為統(tǒng)計各組中神經(jīng)元的數(shù)量及分化比例；CK為對照組，數(shù)據(jù)顯示為 相比CK組，單因素方差分析。圖5 馬錢子苷對神經(jīng)再生的影響Fig.5 Effects of Loganin on neurogenesis

2.5 馬錢子苷對星形膠質(zhì)細胞再生的影響

神經(jīng)干細胞在含有低、中、高濃度馬錢子苷的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后，采用免疫細胞化學(xué)染色檢驗星形膠質(zhì)細胞再生情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，低劑量馬錢子苷處理后，GFAP標(biāo)記的細胞(星形膠質(zhì)細胞)數(shù)量及比例顯著增加(P<0.05)，馬錢子苷中、高劑量組的GFAP標(biāo)記的細胞數(shù)量及比例無明顯變化(P>0.05)(圖6)。

注：A1～D2為神經(jīng)干細胞向星形膠質(zhì)細胞分化的免疫熒光染色圖，GFAP(綠色)標(biāo)記星形膠質(zhì)細胞，DAPI(藍色)標(biāo)記所有細胞核；E和F為統(tǒng)計各組中星形膠質(zhì)細胞的數(shù)量及分化比例；CK為對照組，數(shù)據(jù)顯示為 相比CK組，單因素方差分析。圖6 馬錢子苷對星形膠質(zhì)細胞再生的影響Fig.6 Effects of Loganin on astrocyte regeneration

2.6 馬錢子苷對少突膠質(zhì)細胞再生的影響

神經(jīng)干細胞在含有低、中、高濃度馬錢子苷的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后，采用免疫細胞化學(xué)染色檢驗少突膠質(zhì)細胞再生情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，馬錢子苷低、中、高劑量組的Olig 2標(biāo)記的細胞(少突膠質(zhì)細胞)數(shù)量及比例無明顯變化(P>0.05)(圖7)。

注：A1～D2為神經(jīng)干細胞向少突膠質(zhì)細胞分化的免疫熒光染色圖，Olig 2(紅色)標(biāo)記少突膠質(zhì)細胞，DAPI(藍色)標(biāo)記所有細胞核；E和F為統(tǒng)計各組中少突膠質(zhì)細胞的數(shù)量及分化比例；CK為對照組。圖7 馬錢子苷對少突膠質(zhì)細胞再生的影響Fig.7 Effects of Loganin on oligodendrocyte regeneration

3 討論

成年哺乳動物大腦中的神經(jīng)干細胞是一類具有增殖和分化潛能的干細胞亞群，在神經(jīng)組織受損時，神經(jīng)干細胞經(jīng)歷增殖、分化、遷移、存活和成熟等一系列過程，將新生神經(jīng)元整合到受損腦區(qū)，取代受損神經(jīng)細胞，并建立新的神經(jīng)通路，從而起到神經(jīng)組織修復(fù)的作用[7-11]，提高神經(jīng)干細胞的增殖和分化能力有利于神經(jīng)組織的修復(fù)。本研究發(fā)現(xiàn)成年小鼠神經(jīng)干細胞在含有中、高濃度馬錢子苷的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d后，神經(jīng)球的數(shù)量與對照相比顯著增加，表明中、高劑量的馬錢子苷能夠促進成年小鼠神經(jīng)干細胞的存活。這與以前報道的結(jié)果相一致[12]。神經(jīng)干細胞增殖過程通常與其有絲分裂的速度有關(guān)[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，中、高劑量的馬錢子苷能夠促進神經(jīng)干細胞的有絲分裂過程，并增加神經(jīng)球的直徑，表明中、高劑量的馬錢子苷能夠通過促進成年小鼠神經(jīng)干細胞的有絲分裂活性來提高其增殖能力。

在適宜條件下，神經(jīng)干細胞能夠分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞或少突膠質(zhì)細胞，該過程稱為細胞的“命運決定”[2]。在神經(jīng)干細胞分化的過程中，特殊藥物的干預(yù)能夠影響細胞的命運決定[10-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，低劑量馬錢子苷處理顯著促進神經(jīng)干細胞發(fā)生分化，并增加神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞的數(shù)量及比例，這一結(jié)果表明低劑量的馬錢子苷為神經(jīng)干細胞提供了一個適宜于分化的條件，有利于神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞再生。但中、高劑量馬錢子苷會減少分化的神經(jīng)干細胞數(shù)量，原因可能在于高濃度的藥物干預(yù)對于細胞來說是一個危險信號，這種危險信號可促進神經(jīng)干細胞數(shù)量的增多，并累積大量未分化的神經(jīng)干細胞，這些累計的細胞可分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞等從而應(yīng)對風(fēng)險。故高濃度的馬錢子苷更偏向于促進神經(jīng)干細胞的增殖，相當(dāng)于為神經(jīng)干細胞提供一個足夠的、可供分化的“庫存”。

神經(jīng)干細胞的增殖和分化并非是兩個相互獨立的過程，在成年哺乳動物大腦中，通常需要維持一定數(shù)量的神經(jīng)干細胞[3]。因此，在正常生理條件下，神經(jīng)干細胞的增殖和分化幾乎是同步進行的。但是，在病理條件下，神經(jīng)干細胞的增殖能力可能會受到抑制，進而影響新生神經(jīng)元的數(shù)量，神經(jīng)元代償不足而導(dǎo)致病情惡化。藥物對神經(jīng)干細胞增殖分化的調(diào)節(jié)作用均有明顯的劑量效應(yīng)，濃度過高或過低都有可能呈現(xiàn)相反的效果[10]。本研究發(fā)現(xiàn)50 μmol/L的馬錢子苷能夠促進神經(jīng)干細胞分化，同時也能輕微地促進神經(jīng)干細胞增殖，提示該劑量可能是一個較好的處理劑量。中、高劑量的馬錢子苷能夠顯著促進神經(jīng)干細胞增殖，但會抑制神經(jīng)干細胞分化，這一結(jié)果提示，在治療疾病時，可先用高劑量馬錢子苷誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞增殖，讓體內(nèi)形成大量神經(jīng)干細胞，再用低劑量馬錢子苷誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞分化，便可形成最多數(shù)量的新生神經(jīng)元。這些研究結(jié)果可為神經(jīng)疾病的藥物治療提供線索。